汇报人：LuYinLab博士生一年级钱程
课题组介绍
第一作者：AlisonRingel,JefteDrijvers
通讯作者：ArleneSharpe,MarciaHaigis
AlisonRingel和MarciaHaigis为哈佛医学院细胞生物学系的研究人员，长期聚焦于细胞生物代谢过程开展研究，于年已在MolCell杂志发表关于文章PHD3LossinCancerEnablesMetabolicRelianceonFattyAcidOxidationviaDeactivationofACC2（PMID：），揭示了肿瘤细胞与PHD3有关的脂肪酸代谢途径。近期也在CellMetab杂志发表文章PHD3losspromotesexercisecapacityandfatoxidationinskeletalmuscle（PMID：），深入剖析了PHD3和脂肪氧化的关系。该课题组在细胞代谢方面的研究主要围绕PHD3和脂肪酸代谢。
JefteDrijvers和ArleneSharpe为哈佛医学院微生物与免疫学系的研究人员，为这篇文章免疫相关研究提供了支持。ArleneSharpe为美国国家科学院院士、美国国立卫生研究院院士、哈佛大学微生物和免疫学系的系主任、哈佛医学院终身教授，主要研究T细胞免疫，参与开发的PD-1靶向药物也获得FDA批准。
研究背景
全球肥胖人数日益增多，根据体重指数国际计算公式，体重kg数/身高以m为单位的平方，得出体重是否超重，与年相比已有6.4亿成年人、1.1亿儿童青少年成为了肥胖患者。根据流行病学统计，于年，全球已有万人死于超重和肥胖，与肥胖相关的癌症占据北美、欧洲和中东女性癌症的9%。国际癌症研究机构进行了肥胖对癌症风险的评估，有充足的证据显示体重的增加能够促进结肠癌、食道癌、肾癌和乳腺癌的发展。
肥胖会引起机体代谢系统紊乱，导致血脂异常、高胆固醇、胰岛素抵抗、激素水平变化、炎症水平变化。肥胖同时也能影响肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞生长、转移以及治疗。肿瘤微环境是独特复杂的代谢系统，包含有肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞以及肿瘤间质内容物等，肿瘤细胞代谢特征之一是增加营养消耗满足代谢和生存的需求，活化的T细胞具有高度增殖的能力，也依赖于特定代谢形式以维持自身的效应功能。肿瘤细胞可能会对T细胞代谢需求构成障碍。
结果
01HFDAcceleratesMC38TumorGrowthinaCD8+TCell-DependentManner
为了考察肥胖对肿瘤生长的影响，作者选取5周龄的C57BL/6J小鼠进行随机分组，分别给予控制饮食（CD）和高脂饮食（HFD）喂养8-10周（Fig1A）。在小鼠适应CD或HFD之后，皮下注射MC38结肠癌细胞，构建小鼠肿瘤模型。同时，选择了C57BL/6J同源的E乳腺癌细胞、B16黑色素瘤细胞、LLC肺癌细胞进行肿瘤模型构建。通过对小鼠肿瘤体积的测量发现HFD组小鼠高免疫原性的MC38肿瘤、E肿瘤的生长速度显著快于CD组（Fig1BandC），而中免疫原性B16黑色素瘤的生长速度适度增加（Fig1D）。对于免疫原性较差的LLC肿瘤，HFD组与CD组之间并未存在显著差异（Fig1E）。为了探究HFD诱导肿瘤生长速率的提高是否和T细胞有关，作者选用了T细胞受体α敲除的小鼠（TCRα-KO），皮下注射MC38肿瘤细胞。结果发现，与HFD组相比，CD组小鼠MC38肿瘤生长速率没有显著差异（Fig1F）。与此同时，作者也进行了T细胞耗竭实验，在CD8+T细胞耗尽小鼠中，肿瘤的生长速率也并为依赖饮食的不同而产生变化（Fig1G）。综上所言，这些数据说明HFD依赖T细胞促进MC38肿瘤生长。
02HFDAcceleratesMC38TumorGrowthinaCD8+TCell-DependentManner
为了进一步了解HFD如何调节MC38肿瘤的免疫景观，作者选择10-14天的肿瘤组织进行流式检测，考察肿瘤组织内部免疫细胞浸润（Fig2A）。在HFD组的肿瘤当中，作者观察到CD8+T细胞的减少，但是在脾脏以及引流淋巴结当中并未出现差异（Fig2B）。为了确定减少的CD8+T细胞部分是否对应于细胞整体数量的减少，作者使用GFPMC38细胞并通过流式计算肿瘤细胞的CD45+白细胞和CD8+T细胞，结果发现HFD组小鼠的白细胞和肿瘤细胞的比率降低（Fig2C），以及显著降低的CD8+T细胞与肿瘤细胞比率（Fig2D）。作者接下来考虑HFD对肿瘤中CD8+T细胞活性的功能的影响，测定了T细胞功能有关的标记物。基于Ki67水平的检测，HFD组小鼠的CD8+TIL增殖率显著降低（Fig2E）。HFD组的CD8+TIL的ICOS和PD1表达也显著降低（Fig2FandG）。除此之外，高脂饮食组的CD8+TIL的GZMB表达也显著降低，表明了CD8+TIL功能的下降（Fig2HandI）。HFD并不会改变CD8+T细胞IFN-γ和TNF-α的表达，但是显著上调了IL-2的表达（Fig2J）。除此之外，作者还分析了免疫敏感的E和B16肿瘤当中的T细胞功能变化，结果发现在E和B16肿瘤当中GZMB的表达均显著下降（Fig2MandN）。因此，作者得出结论HFD能够降低肿瘤组织内部的CD8+T细胞数量和功能。
03Single-CellRNA-SeqShowsDiet-InducedAlterationsinTumor-InfiltratingImmunePoputions
接下来，作者使用来自CD和HFD组肿瘤中的CD45+白细胞进行单细胞RNA测序绘制肿瘤免疫转录图谱（Fig3A）。为了定义主要的细胞亚群，作者对单细胞测序进行了聚类分析，明确了16个不同的簇（Fig3B），其中16个簇中每一个都包含了两种不同饮食条件的细胞，并将这些细胞亚群分类为促肿瘤作用和抗肿瘤作用特性的组。HFD组淋巴细胞显著减少，而免疫抑制性的骨髓细胞群比例没有明显变化（Fig3C）。为了以单细胞分辨率绘制HFD引起的代谢改变，作者将61个KEGG代谢基因特征投射到所有细胞上。CD组的白细胞富含KEGG特征包括糖代谢以及氧化还原途径（Fig3D）。相比之下，HFD组肿瘤的白细胞富含参与脂肪和胆固醇代谢、叶酸合成以及戊糖和葡萄糖醛酸相互转化的多种途径（Fig3D）。作者计算了每个簇KEGG代谢评分，比较了不同饮食间的平均分数（Fig3E-G）。作者还分析了参与代谢调节和免疫活动的KEGG信号特征，发现与HFD影响T细胞功能一致的特征表现，在8号簇中，观察到HFD的趋化因子信号传导和T细胞受体信号传导显著减少（Fig3HandI）。最初的聚类分析没有将T淋巴细胞群进行分类，接下来作者将T淋巴细胞作为子集，确定了4个都表达CD3g的子簇（Fig3J）。然后，作者对所有CD8+T细胞的KEGG代谢特征进行评分，这揭示了富含CD与HFD的代谢途径（Fig3K）。由于T-2和T-3簇中的细胞数量很少，作者将后续分析都聚焦到T-0的Tim3+CD8+T细胞亚群上。作者对这一细胞亚群进行富集分析，得到GZMB、TNFRSF9、IFNG、CCL3和CCL4（Fig3L）。与未激活的T细胞相关的特征富含HFD，而刺激活化的T细胞对应特征则富含CD（Fig3M）。为了确定T细胞活化得分较高的细胞是否也对特定代谢得分较高，作者计算了T细胞刺激特征与CD和HFDCD8+T细胞的核心KEGG代谢途径之间的相关性。事实上，代谢途径与HFD肿瘤微环境中的T细胞活化更为显著的相关（Fig3N）。总而言之，单细胞RNA测序分析表明，肿瘤微环境中免疫细胞会经历独特代谢适应HFD，并且T细胞中的差异是独特的。
04HFDRemodelstheTumor-ImmuneLandscapeintheTME
CD8+T细胞发挥对肿瘤的杀伤作用需要充足的能量，因此，作者想探究肥胖是否影响了肿瘤微环境中TIL的位置，以及T细胞在肿瘤中的位置是否与肿瘤内代谢生态位的变化相关。作者使用了CyCIF绘制了TME中细胞的位置和状态。将单细胞RNA测序结果得到的细胞簇在肿瘤组织切片中进行绘制，考察标志物的表达以及代谢特征（Fig4A，BandC）。总体而言，在肿瘤组织染色中可以识别和映射出九种不同的细胞类型（Fig4C）。与之前研究结果发现一致，CyCIF分析显示HFD组肿瘤含有较少的CD8+T细胞，且T细胞并不集中分布在肿瘤的边缘，这是T细胞排斥的标志。作者观察到代谢和标志物的表达随着细胞类型和整个TME变化而变化，糖酵解标志物（GLUT1、PKM2、LDH）的表达在肿瘤当中分布是不均匀的（Fig4D），其他代谢标志物（GLUD1、ACO2、COX4、VDAC1）在肿瘤空间分布更加均匀。为了确定肿瘤代谢状态变化是否与免疫细胞的位置相关，作者测量了免疫细胞群与GLUT1或ACO2的相对位置。GLUT1和ACO2将位于GLUT1或ACO2高表达的区域内CD8+T细胞比例与相同数量的CD8+T细胞进行比较（Fig4G），分析表明HFD组的CD4+T细胞和CD8+T细胞和GLUT1减少（Fig4HandI）。因此，作者虽然在HFD肿瘤中发现了CD8+T细胞，但是所得数据也表明了HFD会改变肿瘤内的代谢生态位相互作用并影响局部T细胞浸润模式。
05HFDCausesOpposingMetabolicChangesinCD8+TCellsversusTumorCells
CD8+T细胞依赖许多与肿瘤相同的能源进行增殖和发挥功能。为了研究肥胖是如何影响肿瘤内不同类型的代谢重编程，作者对来自CD和HFD组的肿瘤内的淋巴细胞、肿瘤细胞以及引流淋巴结进行RNA测序。通过比较来自肿瘤和淋巴结的CD8+T细胞，作者确定了TME中特有的基因表达模式。主成分分析揭示了T细胞活化相关基因（Fig5A），饮食对于肿瘤中的CD8+T细胞转录影响大于引流淋巴结，这表明CD8+T细胞变化是TME中独特存在的。为了了解CD8+T细胞在TME中的独特适应性反应，作者研究了CD8+TIL的转录变化，发现了三个与脂肪合成或胆固醇代谢密切相关的基因ELOVL6、DGAT1和LDLRAP1（Fig5B）。作者对MC38肿瘤细胞在CD或HFD之间的差异表达进行考察，GSEA结果显示缺氧和炎症，CD8+T细胞的转录变化与肿瘤细胞的转录变化并不相同（Fig5C-F），为HFD影响不同细胞的代谢适应提供了证据。为了探索HFD的代谢适应，作者分析了多个代谢基因，确定了肿瘤细胞中Phd3和Nmnat2表达显著降低（Fig5C）。作者也通过qPCR证实，在肿瘤裂解物当中HFD会降低Phd3mRNA表达（Fig5D），相比之下，CD8+TIL中的Phd3表达没有显著变化（Fig5EandF）。因此，作者比较了两个RNA测序数据中FAO基因平均表达水平。作者发现，虽然HFD肿瘤细胞表现出促进FAO的基因表达整体变化（Fig5G），但是这些变化在CD8+TIL当中不存在（Fig5H）。此外，MC38肿瘤细胞糖酵解基因的转录水平变化也要大于CD8+TIL（Fig5IandJ）。这些数据表明，对HFD全身的代谢适应，包括脂肪代谢变化，在肿瘤细胞和CD8+TIL之间存在差异。
06HFDReprogramsFatUtilizationintheTME
为了监测CD8+TIL和肿瘤细胞中的脂质存储情况，作者使用LipidTOX染色检测了中性脂质的积累，作者发现CD8+TIL和MC38肿瘤细胞在两种饮食影响下都是相似水平的中性脂质（Fig5KandL）。为了检测饮食是否会改变脂肪酸摄取，作者使用了BODIPY标记了棕榈酸酯测量棕榈酸酯的摄取。源自HFD的肿瘤细胞比CD的肿瘤细胞吸收更多的脂肪酸（Fig5M）。作者推断肿瘤内在的脂肪利用改变会影响同一环境中的T细胞，虽然饮食没有改变引流淋巴结中的CD8+T细胞对于棕榈酸的摄取（Fig5NandO），但来自HFD喂养的小鼠CD44+CD8+TIL获取的棕榈酸也比CD对应的少（Fig5NandO）。在B16-OVA-RFP和E肿瘤中也是一致的结果（Fig5Q-S）。肿瘤细胞对脂肪酸摄取的增强会导致TME中的T细胞脂肪酸摄取减少，作者进行了体外试验，使用含有少量脂肪酸的培养基刺激未激活的CD8+T细胞，发现给予脂肪酸之后，能够促进CD8+T细胞增殖，使T细胞增殖更好（Fig5TandU）。这说明了高脂饮食引起了肿瘤微环境中的代谢扰动，导致免疫细胞和肿瘤细胞之间存在能源竞争。
07ProteomicAnalysisRevealsFattyAcidUptakeandOxidationSignaturesbyHFDTumorCells
为了更深入了解肿瘤细胞对于HFD的适应性，作者TMT蛋白质组学比较了CD和HFD肿瘤分类的GFP+肿瘤细胞蛋白质组（Fig6A）。个蛋白质主成分分析和聚类分析显示CD和HFD组的MC38细胞具有不同的蛋白质组。使用GSEA发现脂肪酸代谢和氧化磷酸化湿HFD肿瘤细胞中最富集的途径之一（Fig6B）。蛋白质组学分析揭示了HFD通过诱导转运蛋白（SLC27A1）、脂肪酸结合蛋白（FABP5）和参与线粒体氧化蛋白（CPT1A、ACSM3、AVADVL、ETFB、ECHS1）支持肿瘤中脂肪利用的机制（Fig6C、DandF）。相比之下，糖酵解相关的基因被HFD下调（Fig6C-F）。参与脂肪合成的蛋白质没有显著变化，TCA循环蛋白表达会随着HFD增加，这也与GSEA的结果一致（Fig6F）。总结如下，这些蛋白质组学数据支持HFD促进MC38肿瘤细胞进行脂肪酸摄取和氧化。由于脂肪酸氧化特征在HFD组的肿瘤细胞中高度富集，作者使用靶向代谢组检测HFD对循环和TME中脂质水平的影响，结果发现TAG和DAG显示出TIF与HFD显著富集，但是在血浆中没有显著富集（Fig6G-J）。这些数据表明HFD能够显著的促进富含脂质的TME形成。
08TumorCellPHD3ExpressionControlsFattyAcidAvailabilityintheHFDTME
为了检测肿瘤细胞PHD3表达是否能调节游离脂肪酸，作者使用靶向代谢组检测血浆中肿瘤间质液的游离脂肪酸（Fig7A）。HFD增加了许多游离脂肪酸的循环水平，包括了C16:0、C18:1（Fig7BandC）。相比之下，HFD组中间质液内的游离脂肪酸水平显著降低（Fig7D）。接下来，作者比较了MC38PHD3-OE和EV的间质液中游离脂肪酸水平。尽管PHD3过表达对CD组的间质液游离脂肪酸水平没有显著影响（Fig7E），但是HFD能够促进PHD3-OE间质液中游离脂肪酸的增加（Fig7F）。值得注意的是，肿瘤细胞PHD3过表达足以恢复TME中棕榈酸酯的可用性（Fig7G）。因此，促进MC38肿瘤细胞的PHD3表达能够改变TME中的营养可用性。
09TumorCellPHD3OverexpressionPromotesCD8+TCellTumorControl
如果TME内代谢重编程和游离脂肪酸耗尽会降低局部的抗肿瘤免疫力，那么抵消这种局部代谢可能会通过浸润CD8+T细胞来改善肿瘤控制。因此，作者检测了PHD3过表达是否能影响CD8+T细胞对肿瘤控制。作者在CD和HFD组小鼠两侧注射了EV和PHD3-OE的MC38肿瘤细胞，并测量了肿瘤内CD8+T细胞的数量和定位（Fig7H）。MC38肿瘤组织切片使用CD8染色，发现CD8+T细胞耗尽，肿瘤周围和内部的T细胞定位没有重大变化（Fig7J）。作者进一步研究了PHD3过表达对肿瘤生长的影响，PHD3表达不会改变CD组小鼠的肿瘤生长（Fig7K）。与HFD组EV相比，MC38PHD3-OE肿瘤生长减少（Fig7K）。为了验证这一发现是CD8+T细胞介导的过程，作者使用了TCRα-KO小鼠（Fig7L）和CD8+T细胞耗竭小鼠中的肿瘤生长（Fig7M）。PHD3-OE对TCRα-KO小鼠在HFD的肿瘤生长没有显著的影响（Fig7L）。这些数据表明，在MC38肿瘤细胞当中维持PHD3高表达可以改善HFD小鼠的抗肿瘤免疫反应，并减轻HFD对抗肿瘤免疫的影响。总体而言，HFD诱导的肿瘤局部代谢重组会降低TME中的抗肿瘤免疫力。
10PHD3LossCorrelateswithReducedAnti-TumorCD8+TCellFunctionacrossMultipleHumanCancers
为了探索肥胖是否会改变人类患者的肿瘤代谢况，作者分析了TCGA的数据以及BMI数据。发现在BMI≥30的肥胖患者中PHD3显著降低（Fig7N），与COAD患者的正常组织相比，肿瘤组织当中的PHD3表达显著降低（Fig7O）。基于此发现，作者假设肥胖可能会减少肿瘤的T细胞浸润和功能。根据CD8+基因特征对COAD肿瘤进行评分。严重肥胖患者BMI≥35时肿瘤中的CD8+T细胞浸润减少（Fig7P）。然后，作者根绝CD8+基因特征评分将患者样本分为免疫“热”、“中”和“冷”类别（Fig7Q）。不仅PHD3在冷COAD中表达较低，在其他冷肿瘤当中也显著富集。这些数据表明，PHD3在人类癌症中下调和免疫力下降密切相关。
总结与讨论
本篇文章作者研究肥胖如何改变肿瘤微环境中的代谢景观通过抑制T细胞的功能从而促进肿瘤生长。使用代谢、蛋白质组、转录组以及多重组织成像，系统剖析了高脂饮食诱导的肥胖是如何重塑肿瘤内部代谢的，使用单细胞转录测序表征到免疫亚群在肥胖诱导下的代谢变化。肿瘤细胞能够通过上调游离脂肪酸积极来响应高脂饮食的刺激，这种能量争夺的失衡，也是肥胖导致免疫疗法不佳的主要原因，阻断肿瘤细胞对于脂肪酸的摄取能够为T细胞代谢提供能量来源，促进T细胞的功能。因此，机体肥胖影响肿瘤内部代谢纠缠，即肿瘤细胞与T细胞之间对于脂肪酸的争夺，通过增强肿瘤细胞PHD3的表达能够抑制肿瘤细胞对于脂肪酸的摄取，促进T细胞的浸润，恢复抗肿瘤免疫。
关于肥胖增加癌症发生率的报道屡见不鲜，其中关于脂肪酸代谢也有报道。但是机体系统代谢差异是如何改变肿瘤微环境并影响到肿瘤免疫是缺乏的。本文证明了高脂饮食诱导的肥胖能够降低肿瘤微环境中CD8+T细胞的功能，从而加速肿瘤生长。通过分离出肿瘤组织内部的T细胞生成单细胞分辨图谱，发现T细胞的独特代谢方式，并且与肿瘤细胞呈现出不同的代谢适应性，肿瘤细胞通过高脂饮食增加脂肪酸摄取，引起脂肪酸分配不均衡，使得CD8+T细胞浸润与功能受损。那么，阻断肿瘤细胞代谢重编程即可提高抗肿瘤免疫力。通过对人类癌症数据库的检索与分析，CD8+T细胞标志物的转录变化，表明可以利用代谢改善肿瘤免疫的治疗效果。
导师：陆茵
稿件编辑：宗港凡
稿件审阅：陆茵
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