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今天推荐的是由美国德克萨斯大学MDAnderson癌症中心在年2月7日发表于NatureCommunications（IF：14.，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是MinSupSong教授，研究表明PTEN通过USP11经PI3KFOXO途径进行自我调节，稳定肿瘤抑制作用。研究背景
PTEN是一种脂质磷酸酶，可拮抗PI3K/AKT通路，被认为是主要的剂量依赖性肿瘤抑制因子。因此，控制PTEN水平的细胞机制提供了潜在的癌症治疗途径，但这些机制尚不明确。摘要部分
在这里，作者证明PTEN通过PI3K/FOXO途径对去泛素化酶USP11的转录上调，在调节其自身稳定性方面发挥了重要的作用，并进一步表明这种前馈机制与其抑制肿瘤作用有关，因为缺乏Usp11的小鼠显示出对PTEN依赖的肿瘤发生、生长和转移的敏感性增加。USP11在癌症患者中被下调，并且与PTEN表达和FOXO核定位相关。因此，作者的研究结果表明PTEN-PI3K-FOXO-USP11构成了调节前馈回路，可提高PTEN的稳定性和肿瘤抑制活性。研究内容
1.USP11通过上调PTEN来拮抗PI3K活性为了鉴定调节PI3K/AKT途径的DUB，通过系统筛选，作者基于PTEN蛋白积累将USP11鉴定为PI3K/AKT途径的有效抑制剂（图1a,b）。然后通过相互免疫沉淀来确定内源性USP11和PTEN之间的结合（图1c）。值得注意的是，野生型(WT)USP11在体内和体外使PTEN去泛素化，而催化失活的USP11CS(CS)突变体仍然可以与PTEN结合，但其去泛素化PTEN的能力显着减弱（图1d）。WTUSP11的过表达也增加了PTEN水平（图1e）。为了进一步确定USP11是否可以调节PTEN蛋白的稳定性，作者接下来研究了在放线菌酮（CHX）（一种蛋白质合成抑制剂）存在下的内源性PTEN蛋白水平。重要的是，在USP11下调后，NB4人APL细胞中内源性PTEN蛋白的稳定性显着降低（图1f）。作者之前已经证明，HAUSP专门去除了PTEN的单泛素化以用于其核输出。因此，作者测试了USP11是否可以去除细胞核中PTEN的单泛素化。虽然HAUSP去除了PTEN的单泛素化，但USP11没有去除PTEN的单泛素化，这表明USP11代表了一种独特的DUB，可以在细胞核中去多聚泛素化并稳定PTEN。为了进一步测试USP11通过PTEN拮抗PI3K活性，作者通过PTEN+/+和PTEN-/-MEF中的RNA干扰敲低了USP11。胰岛素刺激导致急性AKT磷酸化，以及Usp11敲低的细胞中PIP3的增加，其水平高于在Pten+/+对照细胞中观察到的水平，这意味着USP11具有PTEN依赖的PI3K抑制功能（图1g,h）。在刺激血清、IGF-1或EGF时观察到类似的结果。
图1.USP11通过去泛素化和稳定PTEN来降低PIP3水平
研究结论：USP11可以逆转PTEN的多泛素化，稳定PTEN蛋白，从而抑制PI3K/AKT通路的激活。2.Usp11的丢失诱发了细胞的生长、运动和代谢作者随后探究USP11在体内的生物学功能。基因靶向盒包含新霉素抗性基因(neoR)lacZ，并已整合到USP11的外显子中以产生USP11-的功能失调等位基因。由于USP11是X连锁基因，杂合子雄性（Usp11-/Y）胚胎足以产生USP11功能缺失突变。与WT相比，从USP11-/Y胚胎分离的原代MEF中，内源性PTEN蛋白（但不是mRNA）的水平降低，AKT及其下游靶标的磷酸化率增强。鉴于PTEN的肿瘤抑制作用，作者推测USP11的缺失可能会促进多个致瘤过程。事实上，原代USP11-/YMEF显示出比它们的WT对应物更高的增长率（图2a,b）。腺病毒E1a与活化的Ha-ras、SV40largeT抗原（T-Ag）或p16INK4a和p19ArfshRNA组合的转化效率，在USP11缺陷细胞中的转化效率也显着高于WT培养物（图2c）。用这些转化细胞在体内产生小鼠同种异体移植物，证实了USP11的关键肿瘤抑制功能（图2d）。当USP11-/YMEF进行伤口愈合试验时，发现USP11-/YMEF比WT细胞更快地闭合伤口（图2e）。还注意到，USP11缺失后细胞运动性的增加伴随着基质金属蛋白酶的上调（图2f）。此外，与WT对应物相比，USP11缺陷细胞显示出更高的葡萄糖摄取率、乳酸产生率和谷氨酰胺消耗率（图2g）。相比之下，过表达USP11的细胞表现出葡萄糖和谷氨酰胺代谢受损，伴随着质膜组分中GLUT1（1型葡萄糖转运蛋白）的表达降低（图2h,i）。
图2.USP11的缺失会增加细胞增殖、运动和代谢
研究结论：USP11的缺失会增加细胞增殖、运动和代谢。3.Usp11基因敲除会增强TRAMP小鼠的肿瘤进展USP11-小鼠（Usp11-/Y和USP11-/-）是能够存活的并且以预期的孟德尔比率出生。由于PTEN水平降低与小鼠前列腺肿瘤的发生和进展增加相关，作者评估了USP11在体内前列腺肿瘤发生中的作用。值得注意的是，11周龄的USP11-/Y小鼠表现出显着增大的前列腺叶和增加的前列腺上皮细胞增殖（图3a-c）。作者将USP11-/Y小鼠与TRAMP（转基因腺癌小鼠前列腺）小鼠杂交，以驱动SV40T抗原(Ag)34的前列腺特异性表达。使用SV40TAg的临床意义在于它通过结合和灭活Trp53和Rb1肿瘤抑制基因来诱导致癌性进展。为了研究USP11敲低对前列腺的早期影响，在10周龄时处死了不同USP11背景的TRAMP小鼠，并进行了组织病理学分析。USP11-/Y小鼠的高级前列腺上皮内瘤变（HG-PIN）发生率显着高于年龄匹配的TRAMP；Usp11+/Y小鼠（图3d,e）。磁共振成像MRIMRI分析显示，与年龄匹配的TRAMP;Usp11+/Y队列相比，20周大的TRAMP;Usp11-/Y小鼠的前列腺中存在更大的肿瘤肿块（图3f）。通过苏木精和伊红染色的组织学观察发现，TRAMP;Usp11-/Y小鼠有严重的恶性进展，而年龄匹配的TRAMP;Usp11+/Y小鼠的前列腺则保存下来，组织呈现出PIN表型（图3g）。值得注意的是，与TRAMP对照小鼠相比，TRAMP;Usp11-/Y小鼠表现出较低的PTEN表达水平和较高的AKT磷酸化水平。SMA染色显示，与年龄匹配的TRAMP;Usp11+/Y小鼠相比，TRAMP;Usp11-/Y小鼠有高度渗透性的浸润性前列腺腺癌（图3h）。此外，多个肿瘤结节转移到TRAMP;Usp11-/Y小鼠的淋巴结比在TRAMP;Usp11+/Y小鼠中的发生率要低得多（图3i）。
图3.USP11敲低促进TRAMP小鼠的肿瘤生长和转移
研究结论：USP11作为前列腺癌发生、进展和转移的潜在X连锁肿瘤抑制因子。4.USP11介导的肿瘤抑制作用依赖于PTEN前列腺癌，ERG基因经常易位到TMPRSS2启动子区域，由于异常ERG表达与PTEN单倍体不足共同促进癌症进展，作者评估了USP11缺失是否会影响ERG依赖性细胞过程。USP11的敲低增强了稳定过表达ERG（22Rv1ERG）的ERG阴性22Rv1人前列腺癌细胞中的生长、侵袭以及葡萄糖和谷氨酰胺代谢。为了进一步研究USP11DUB活性对USP11介导的肿瘤抑制的贡献，作者使用了人类单倍体癌细胞系HAP1，其中USP11的单个等位基因已被CRISPR/Cas9技术敲除。重新引入WT，而不是无催化活性的CSUSP11导致癌细胞生长、侵袭以及葡萄糖和谷氨酰胺代谢减少（图4a-c）。在USP11敲除MEF中观察到类似的结果。接下来，作者测试了USP11是否通过PTEN调控发挥肿瘤抑制器的功能。过表达USP11抑制了PTEN回补PTEN失活的人类前列腺癌细胞（PC3PTENWT）的生长，但没有抑制表达对照载体的PC3细胞（PC3PTEN-/-）。USP11的过表达也降低了PC3PTENWT而非PC3PTEN-/-细胞的侵袭能力（图4e）。USP11过表达同样导致PC3PTENWT细胞中葡萄糖摄取、乳酸产生和谷氨酰胺消耗减少，而在PC3PTEN-/-细胞中未观察到显着差异（图4f）。相反，敲低USP11会增强PC3PTENWT细胞而非PC3PTEN-/-细胞的细胞生长、侵袭和能量代谢（图4g-i），表明USP11发挥PTEN依赖性肿瘤抑制功能。
图4.USP11以PTEN依赖性方式抑制癌细胞生物学
研究结论：USP11介导的肿瘤抑制作用依赖于PTEN。5.在人类癌症中，USP11减少并与PTEN相关联人类前列腺癌的转录组分析显示，USP11转录物的表达在原发性前列腺肿瘤中被下调，其减少与肿瘤的侵略性密切相关（图5a）。在人类乳腺肿瘤中也观察到USP11的下调46（图5b）。作者通过从另一个可用的数据库中提取的癌症患者生存分析，进一步证实了USP11下调的临床意义（图5c），这表明其抑制可能会影响肿瘤性恶性肿瘤和临床结果。为了确定USP11对PTEN调节的临床意义，作者研究了人类前列腺癌和三阴性乳腺癌（TNBC）样本的肿瘤组织微阵列（TMA）。首先，PTENDNA状态的荧光原位杂交（FISH）分析显示，在作者的前列腺和TNBCTMAs中，85.3%和83.5%分别有两个PTEN拷贝（图5d）。然后，作者研究了这些两个PTEN基因拷贝病例的TMA中，USP11的表达水平是否与PTEN蛋白水平相关。值得注意的是，对人类前列腺肿瘤的免疫组化分析表明，USP11和PTEN蛋白水平之间存在统计学意义上的正相关（图5e）。同样，在TNBC样本中，USP11和PTEN蛋白水平之间也存在高度正相关。
图5.USP11在人类癌症中被下调并与PTEN相关
研究结论：在相当一部分人类恶性肿瘤中，USP11被下调，在没有PTEN基因组丢失的情况下，USP11表达的减少可以作为PTEN失活的一种机制发挥作用。6.USP11介导细胞密度依赖的PTEN调节正常细胞在达到汇合后通常会停止增殖，这种现象称为细胞接触抑制。然而，致癌基因的激活和抑癌基因的失活可以阻止接触抑制。因此，作者测试了细胞密度对USP11介导的PTEN调节的影响。有趣的是，PTEN表达在以高细胞密度生长的初级和转化MEF中都大大增加（图6a）。在高细胞密度下观察到的PTEN升高不是由于PTEN转录速率的增加，因为PTENmRNA保持不变（图6b）。此外，稀疏细胞中的PTEN蛋白周转率更高，内源性PTEN免疫沉淀物在低密度细胞中比在高密度细胞中表现出更重的多泛素化模式（图6c,d）。作者接下来测试了细胞密度对USP11介导的PTEN调节的影响。令人惊讶的是，USP11的mRNA水平在密集细胞中远高于稀疏细胞（图6e）。更重要的是，USP11的敲低抑制了高密度诱导的PTEN上调（图6g）。
图6.USP11介导细胞密度依赖的PTEN调节
研究结论：细胞密度通过USP11的转录调节来控制PTEN蛋白的生理水平。7.FOXO是USP11的关键转录激活剂为了研究USP11如何受细胞密度的转录调控，作者通过数据库寻找USP11启动子。在多个候选者中，作者对FOXO特别感兴趣，因为已知它是高密度诱导基因激活的关键参与者（图6a）。在高密度条件下，Foxo1shRNA确实损害了USP11的蛋白质和mRNA水平的升高，但不损害其他DUB（图6h）。同样，Foxo1敲低显着降低了USP11启动子报告基因构建体pUSP11-Luc的荧光素酶活性，而FOXO1、3或4的过表达强烈促进了USP11的转录激活（图6i）。内源性FOXO1蛋白与包含USP11启动子内关键FOXO结合位点的区域结合，高细胞密度显着增强了FOXO1的结合（图6k），表明FOXO蛋白可以直接激活USP11的转录。更重要的是，Foxo1的敲低削弱了原代MEF中高密度诱导的PTEN上调（图6l），表明FOXO在PTEN表达的生理调节中起重要作用。FOXO的激活可以通过乙酰化控制，白藜芦醇诱导SIRT1介导的FOXO去乙酰化（图7a）。因此，作者测试了白藜芦醇是否通过SIRT1/FOXO诱导USP11转录。白藜芦醇增加了USP11蛋白和mRNA水平，但这种效果因SIRT1的敲低而减弱（图7b）。敲低FOXO1同样降低了白藜芦醇对USP11转录激活的影响（图7c），表明白藜芦醇至少部分通过SIRT1/FOXO途径促进USP11表达。值得注意的是，白藜芦醇显着提高了PTEN水平，主要是通过增加PTEN蛋白的稳定性（图7d）。更重要的是，在USP11敲低的细胞中，白藜芦醇对PTEN蛋白水平的升高降低（图7e,f），表明白藜芦醇通过USP11的激活上调PTEN蛋白表达。作者还发现缺乏AKT磷酸化位点的FOXO活性核突变体的过表达导致USP11启动子活性的显着增加（图7g）。
图7.FOXO激活了USP11的表达，从而上调了PTEN
研究结论：FOXO是USP11的关键转录激活剂。8.PTEN通过信号前馈机制进行自动调控作者首先观察到，与WT亲本（PTEN+/+）或杂合子（PTEN+/-）细胞相比，同源PTEN缺失（PTEN-/-）HCT结肠癌细胞中USP11的蛋白质和mRNA水平明显降低，而其他任何已知的PTENDUBs则不然（图8a,b）。荧光素酶报告试验显示，PTEN的缺失同样抑制了USP11启动子的活性（图8c），值得注意的是，在PTEN缺陷的细胞中，FOXO1与USP11启动子中一个关键的FOXO结合点的结合受到影响（图8d）。与这些体外结果相一致的是，在Pten基因敲除的小鼠前列腺中，当PIN的发生率和细胞增殖率较低时，USP11被证明是下调的（图8e），这意味着PTEN在体内控制USP11的表达中起着关键作用。接下来，为了阐明PTEN/PI3K/AKT信号通路对USP11调控的贡献，作者在PI3K/AKT通路被阻断时测试了USP11的表达。值得注意的是，BKM或LY对PI3K的抑制显着增加了USP11蛋白和mRNA水平，伴随着PTEN的上调（图8f）。相反，用有效的PTEN抑制剂VO-OHpic4处理导致USP11表达降低，伴随着PTEN的下调（图8g）。此外用蛋白酶体抑制剂MG处理并没有导致用BKM抑制PI3K或消减PI3K的调节亚基p85所诱发的PTEN蛋白水平进一步增加（图8h,i），这表明PTEN调节环是由泛素-蛋白酶体途径介导的。另一方面，表达PTENCS或PTENGE磷酸酶无活性的突变体导致USP11的蛋白质、mRNA和启动子活性水平显著降低（图8j）。总之，这些结果表明，PTEN-PI3K/AKTFOXO和USP11-PTEN整合成一个PTEN前馈信号网络（图8k）。
图8.PTEN-PI3K-FOXO-USP11的自动调节前馈机制
研究结论：PTEN通过信号前馈机制进行自动调控。
结论与讨论
Thankyou!
往期链接1.乳腺癌中USP1通过泛素化修饰调控TAZ蛋白的稳定性2.想发高分文章？或许可以试下这个研究思路，赶紧学习下3.USP1靶向ULK1并调节其细胞区室化和自噬4.去泛素酶USP1的抑制使KPNA2不稳定并抑制乳腺癌转移5.β-catenin的异常激活可通过USP1稳定EZH2驱动神经胶质瘤的发生6.综合分析USP1在肝癌中的重要作用7.FANCI和FANCD2不同的泛素化功能使ID2-DNA稳定结合8.Rheb泛素化调控生长因子诱导的mTORC1激活9.FA蛋白FANCI在核糖体的生物合成中发挥作用10.ATR介导的FANCI磷酸化同时调控FANCD2的泛素化和去泛素化11.USP1通过去泛素化Akt抑制长期饥饿时肌肉中的PI3K-Akt-Foxo信号转导12.USP2通过拮抗E3-泛素连接酶IDOL调控LDLR信号通路预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇