持续的O-GlcNAc修饰重编程线粒体功能以调节能量代谢
摘要
功能失调的线粒体和活性氧(ROS)的产生促进了慢性疾病，这激发了人们对这些条件背后的分子机制的兴趣。在此之前，我们已经证明，通过过表达O-GlcNAc调节酶O-GlcNAc转移酶(OGT)或O-GlcNAcase(OGA)对β连接的N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)的蛋白质翻译后修饰的破坏会损害线粒体功能。在这里，我们报告了通过药理学或遗传操作对O-GlcNAc的持续改变也会改变代谢功能。SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的持续性O-GlcNAc升高增加了OGA的表达，减少了细胞呼吸和ROS的产生。O-GlcNAc水平升高的细胞线粒体延长，线粒体膜电位增加，RNA测序分析表明转录组重新编程和NRF2介导的抗氧化反应下调。小鼠大脑和肝脏中持续的O-GlcNAc验证了在细胞中观察到的代谢表型，而肝脏中的OGT敲低提高了ROS水平，呼吸受损，增加了NRF2抗氧化反应。此外，O-GlcNAc水平升高促进小鼠体重减轻和呼吸降低，并通过间接量热法确定小鼠转向碳水化合物依赖性代谢。总之，O-GlcNAc的持续升高以及OGA表达的增加可以重塑能量代谢，这一发现对代谢性疾病的病因学、发展和管理有潜在的影响。
一、研究背景与介绍
线粒体呼吸长期受损和不受控制的活性氧(ROS)都导致了复杂的慢性疾病。改善线粒体功能和减少不受控制的ROS产生的干预措施将在慢性疾病的治疗中有广泛的临床应用。葡萄糖氨(GlcN)是一种常见的氨基糖治疗，改善了线粒体功能，延长了秀丽隐杆线虫和老鼠两种心脑炎的寿命。GlcN治疗增加了线粒体呼吸和短暂诱导的线粒体ROS生成，随后ROS显著降低。最初的瞬态ROS诱导促进线粒体生物发生，并改善抗氧化反应，导致寿命延长。值得注意的是，GlcN在限速酶谷氨酰胺果糖-6-磷酸转氨酶1(GFAT)后，进入己糖胺生物合成途径(HBP)，导致GlcNAc增加；因此，我们假设O-GlcNAc调节线粒体功能、氧化应激反应，并可能影响慢性疾病进展。
O-GlcNAc是在核、细胞质和线粒体蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基中添加单一的O连接的β-乙酰葡萄糖氨基糖部分。O-GlcNAc由两种功能上相反的酶促进，OGT催化添加O-GlcNAc和OGA水解修饰。在催化过程中，OGT使用了由HBP生成的核苷酸糖UDP-GlcNAc。GlcN进入GFAT1下游的HBP，并通过提高UDP-GlcNAc的合成来增加细胞O-GlcNAc。因此，GlcN对线粒体功能和寿命延长的影响可以通过O-GlcNAc来介导。由于UDP-GlcNAc的合成依赖于多种代谢途径的整合，O-GlcNAc可以感知营养物质的变化。重要的是，营养不平衡引起的O-GlcNAc慢性破坏影响代谢性疾病。
O-GlcNAc是线粒体功能的一个关键调节器。OGT和OGA都定位到线粒体上，嘧啶核苷酸载体1(PNC1)将UDP-GlcNAc运输到为OGT提供底物的线粒体中。几种电子输运链(ETC)亚基被O-GlcNAC修饰，表明O-GlcNAC调节ETC活性。例如，短期高糖治疗可以提高O-GlcNAC，但抑制大鼠心肌细胞的ETC活性和ATP产生；然而，大鼠的短期OGA抑制增加了分离线粒体的氧消耗。OGT或OGA在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的过表达会改变线粒体蛋白组，包括几个TCA周期和蛋白等。ETC蛋白表达的丧失对线粒体的形状和呼吸的受损产生了不利影响。这些数据表明，O-GlcNAc对正常调节线粒体功能和能量代谢至关重要。
在这里，我们报告了通过抑制OGA或补充GlcN来增加细胞系和小鼠中的O-GlcNAc可以重新编程线粒体功能并改变能量代谢。O-GlcNAc持续升高降低呼吸，降低ROS的产生。这些变化之后，蛋白组的转录重新编程和转录因子核因子（红细胞衍生的）样2(NRF2)介导的氧化应激反应的减少。相比之下，OGT肝敲除严重受损线粒体功能，增加ROS水平，并激活NRF2抗氧化反应。总之，这些数据证明了O-GlcNAc在调节线粒体功能方面的不同作用，并为O-GlcNAc的药物靶向如何预防衰老和新陈代谢疾病提供了新的见解。
二、结果解读
1.Thiamet-G(TMG)orglucosamine(GlcN)treatmentaltersmitochondrialbioenergeticcapacity
延长GlcN治疗可改善线粒体功能，并延长秀丽隐杆线虫和小鼠两者的使用寿命。我们假设O-GlcNAc的持续升高会改变能量代谢。为了确定O-GlcNAc如何影响能量代谢，我们用TMG(10μM)或GlcN(0.35mM)至少3周治疗SH-SY5Y神经母细胞瘤。TMG是一种高选择性OGA抑制剂，而GFAT1后GLcN进入UDP-GlcNAc细胞池的生物合成途径。与GLcN相比，TMG仅针对OGA来精确地操纵O-GlcNAc化。
TMG-和GlcN处理的SH-SY5Y细胞均增加了总水平和线粒体O-GlcNAC水平(图1a和b）。虽然不显著，但OGT蛋白和转录水平的趋势较低；而OGA蛋白和转录水平显著升高，以响应O-GlcNAC的升高(图1a和d)。在TMG处理的细胞中，GFAT1蛋白水平下降(图1a)。在GlcN处理的SH-SY5Y细胞中，OGA特异性活性增加(图1e)。在用TMG或GlCN治疗的NT2人畸胎癌细胞中也发现了类似的结果(图1c)。
GlcNAc的长期升高改变了SH-SY5Y细胞的细胞呼吸(图2a)。TMG降低了基线耗氧率(OCR)，而GlcN增加了基线OCR(图2b)。在基础条件下，存在TMG的体内ATP产生较低，但在GlcN处理的细胞中则较高(图2f)。这两种处理方法都不影响质子的泄漏率(图2c)。GlcN细胞的最大呼吸速率增加，而TMG与对照细胞相似(图2d)。无论TMG或GlcN治疗如何，在氧化培养基中生长的SH-SY5Y细胞都没有储备能力(图2e)，表明这些细胞正在以其最大的能力呼吸。为了消除任何细胞类型的特异性效应，我们对NT2细胞进行了呼吸试验。TMG处理的NT2细胞复制了来自SH-SY5Y细胞的数据(图2i-n)。在NT2细胞中，GlcN处理反映了TMG处理的SH-SY5Y/NT2细胞的结果显示较低的呼吸率(图2i-n)。NT2细胞的线粒体比SH-SY5Y细胞有更多的储备能力，这表明这些细胞并没有以最大的速度呼吸。TMG和GlcN处理的SH-SY5Y细胞和TMG处理的NT2细胞的总细胞ATP水平都较低(图2g和o）。TMG治疗导致SH-SY5Y和NT2细胞产生ATP。很可能，GlcN处理的SH-SY5Y细胞由于六糖激酶磷酸化为GlcN-6-P而产生并消耗了更多的能量。
由于氧化磷酸化和糖酵解是相互依赖的能量产生途径，因此我们通过测量细胞糖酵解通量来检查糖酵解能量的产生。TMG-和GlcN处理的SH-SY5Y细胞都具有较低的基础糖酵解率(图2h)。而TMG处理的NT2细胞的基底糖酵解率较，经GlcN处理的NT2细胞没有任何变化(图2p)。
2.TMGorGlcNtreatmentincreased