默克尔细胞癌衍生外体穿梭miR [复制链接]

默克尔细胞癌（MCC）是一种侵略性神经内分泌（NE）皮肤癌，估计死亡率为在大多数情况下，MCC致癌与致癌的Merkel细胞多瘤病毒有关，而在其他情况下，它是UV驱动的。MCCs是异质肿瘤，经常被各种免疫和频闪细胞渗透。虽然肿瘤渗透淋巴细胞的作用已经详细研究，肿瘤相关成纤维细胞在MCC微环境的特点在很大程度上尚未探索.成纤维细胞是非常塑料细胞，可能有助于肿瘤进展和转移取决于其极化和激活状态。因此，肿瘤促进成纤维细胞也被称为癌症相关的成纤维细胞（CAFs）。CAF的特点是主轴形状与拉长细胞质过程，表达标记，如α平滑肌肉作用素（α-SMA）和调节亲炎基因，如C-X-C图案化疗素2（CXCL2）和白细胞通素1β。成纤维细胞极化是通过内在和外在的中介触发的;但是，这个过程没有完全理解。然而，癌细胞衍生刺激被认为是导致CAF极化的主要因素。它们的作用可以通过直接细胞接触或通过可溶性因子或分子，主要在细胞外囊泡（EV）中运输，如凋亡性球状，微囊，或外体.外体直径为30~nm，通过多静脉内膜与血浆膜的融合积极释放，可稳定地在血液、淋巴和其他体液中持续。外显子可以包含大量的功能分子，包括蛋白质、DNA、mRNA和非编码RNA。因此，外泌体对内分泌和寄生虫细胞细胞的通信很重要。微RNA（miRNA）在外体中特别常见，因为它们的19-24核苷酸体积小。值得注意的是，一些miRNA在外体中选择性地丰富；这些mirnas被归类为外体穿梭米纳斯。肿瘤和频闪细胞之间通过外体穿梭miRNA影响肿瘤增殖，血管生成，转移，免疫，以及CAF活化。

MCC细胞中最丰富的miRNA之一是miR-。其在MCC中的功能尚未完全描述，但可能促进MCC细胞的NE分化。MCPyV编码的大T抗原或NElinage转录因子ATOH1的截断版本的过度表达诱导miR-表达。除了在MMC中表达外，miR-还用甲状腺癌、前列腺癌和NE肺癌表示。miR-的生理功能最好用它在胰腺β细胞中的作用来描述，在胰腺β细胞中，它是胰岛素分泌的重要调节剂。miRNA通过干扰mRNA的稳定性或抑制其平移而发挥作用;miR-的实验确认目标基因是免疫球蛋白卡帕J区（RBPJ）和TP53的重组信号结合蛋白。在大多数癌症中，miR-被认为是肿瘤抑制剂，但它也作为一个致癌的miRNA，这取决于细胞背景.我们最近报告说，MCC细胞系中miR-的敲击对细胞生存、增殖和形态的影响最小。高效的击倒并没有改变任何涉及miR-目标基因的信号通路，从而提出了关于这种高度丰富的miRNA在MMC中的功能作用的问题。根据我们的观察，miR-存在于MMC条件细胞培养基以及MMC患者的血清[27]中，它可以作为外体穿梭miRNA。在这里，我们提供证据，证明水平转移的miR-对于成纤维细胞向MCC中CAF表型的极化非常重要。

miR-通过外向梭在细胞间信号过程中通过外向梭穿梭作用，并且可以在肿瘤微环境中使频闪细胞极化。因此，我们通过评估其他成纤维细胞标记，使用多路复用免疫体化学（mIHC）染色来描述成纤维细胞的表达，TE-7在大多数频闪细胞中以低水平表达，但有少数例外。α-SMA是由血管附近的成纤维细胞样细胞和环斑细胞表达的，并且经常与CACA1进行结肠。与α-SMA不同，SA4主要在肿瘤中分布的单细胞中表达，只有一定程度的与α-SMA的共定位。值得注意的是，我们并没有观察到与成纤维细胞极化有明显差异，这取决于肿瘤中是否存在MCPyV。这些形态学分析表明，MCC相关的成纤维细胞是异质的，尽管大多数都表现出CAF一样的表型。

我们使用10XGenomics对三个MMC肿瘤进行单细胞RNA测序（scRNAseq）。T分布式随机相邻嵌入（tSNE）将这些细胞聚类到MCC肿瘤细胞、成纤维细胞、T淋巴细胞和内皮细胞中（数据未显示）。值得注意的是，tSNE根据三个肿瘤的表达特征，将MCC相关成纤维细胞分成两个簇。大多数成纤维细胞表示成熟的CAF标记，如成纤维细胞活化蛋白;Thy-1细胞表面抗原;平滑肌肉行为阿尔法2（α-SMA编码ACTA2）;卡沃林1号（CAV1）;和不同的胶原蛋白酶。然而，这些标记在成纤维细胞中表达在不同水平。因此，我们根据88个CAF相关基因的表达特征生成了CAF评分，这些基因还确定了所有三个肿瘤中的两组成纤维细胞。此外，上述三个肿瘤的组合成纤维细胞簇也归入CAF低和卡夫高根据各自的CAF分数值组。为了确定每个肿瘤中的这两组成纤维细胞是独立开发的，还是仅仅在CAF极化的不同阶段，我们计算了RNA速度，根据拼接和未拼接转录本的相对比率预测单个细胞的未来状态。这一分析表明，这两个成纤维细胞簇在所有三个肿瘤都指向不同的未来状态，如RNA速度载体可视化的主要成分分析（PCA）。综上关于MCC相关的成纤维细胞表现出显著的异质性和不同的极化状态，免疫组织化学染色和scRNAseq的结果都表明这一点。在此基础上，我们接下来研究这些影响是否由miR-的水平转移触发。

通过使用定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）比较先前报告高表达miRNA（miR-19b，miR-b，miR-，miR-c，和miR-）在WaGa细胞和条件介质（CM）从WaGa细胞.虽然所有测试的miRNA在细胞中富含，但只有miR-在CM中存在相关量。miR-在无细胞上充液中具有强大的优势，表明WaGa细胞主动和选择性地释放miR-，大概通过外在富集。为了验证这一假设，我们从经典miR-表达MCC细胞系（WaGa、PeTa、MKL-1和UM-MCC-13）的CM中分离出EV;这些EV的尺寸通常介于50和nm之间，CD63和Tsg为阳性，两个常见的EV标记，并且是Calnexin的阴性，这是免疫布洛特标识的内质神经素的标记。与相应的CM相比，miR-在这些EV中具有丰富的丰富性，但在从miR-阴性细胞系MCC13和SCL-2派生的EV中无法检测到。MCC衍生的电动汽车被染上了Exo-Red，以调查它们是否可以被成纤维细胞所占。MRC-5成纤维细胞和成纤维1.12原发性皮肤成纤维细胞在3小时内均匀地合并了标有EV。这些观测结果有力地支持了miR-从MCC细胞水平转移到成纤维细胞有助于细胞间交流的假设。

为了探索MCC衍生因子对成纤维细胞的功能影响，我们进行了一系列实验，共同培养miR-，表达WaGa、PeTa细胞或miR--阴性MCC13细胞与成纤维细胞。测试了三种不同的共培养条件：直接细胞接触（DC）、跨井腔室系统（TC）和MCCCM。对于所有后续实验，我们使用成纤维细胞系MRC-5和原发性成纤维细胞。虽然原发性皮肤成纤维细胞在生物学上更相关，但它们的特点是扩张能力有限;因此，必须使用不同捐赠者的主要皮肤成纤维细胞来确保可重复性和生物相关性。由于成纤维细胞（粘附体）和经典MCC细胞（悬浮细胞）的生长模式不同，在随后的分析之前，它们很容易分离。然而，变种MCC细胞系MCC13并不表现出经典的MCC细胞生长模式，因此，该细胞系未用于直流实验。从这些实验中首次发现，这两种培养条件都导致MIR-在MRC-5和原发性成纤维细胞中出现。检测到的miRNA量变化很大，在直流条件下的测量量最大，在CM条件下是最低的。由于两条成纤维细胞线在单独培养时均未表示miR-，且没有诱导原始miR-的培养条件，miR-表达在成纤维细胞中未诱导;相反，miR-从MCC细胞转移到成纤维细胞。接下来，通过测量CAF标记的mRNA表达，即ACTA2、CXCL2和IL1B，分析了从MMC细胞传输的EVs货物对成纤维细胞的功能效应。与最高的miR-吸收一致，CAF标记，特别是ACTA2，在直流条件下的成纤维细胞中也表现出最高的表达。此外，α-SMA表达在蛋白质水平上被诱导，细胞的细胞的免疫印迹和免疫荧光（IF）染色就证明。后一种测定还揭示了与成纤维细胞中CAFF样表型一致的大量形态变化，例如在共培养条件下发展拉长的硬质形状。先前描述的成纤维细胞极化的特点是细胞的纵横比变化。事实上，在各自的培养条件下对细胞长宽比进行量化证实了这种变化，如果有可能直接细胞接触，则这种变化对M经C-5细胞和原发性成纤维细胞来说都是最突出的。

由于从MCC细胞转移的许多因素都可能导致成纤维细胞极化，我们接下来评估了miR-导致观测效果的程度。因此，我们在成纤维细胞中实验诱导了miR-。miR-的异位表达导致CXCL2、IL1B和ACTA2的mRNA表达增加。α-SMA蛋白表达也诱导在miR-的异位表达，由免疫印迹和F1染色确定。此外，这些成纤维细胞的形态向CAF表型改变，但程度低于与miR-表达MCC细胞共同培养的成纤维细胞。因此，这些结果提供了确凿的证据，证明miR-足以使成纤维细胞极化。大多数miRNA通过干扰mRNA的稳定性或抑制其平移而起作用;RBPJ和TP53是miR-的目标基因，对于减少的表达都与成纤维细胞极化。在这里，我们确实观察到RBPJ和TP53mRNA和蛋白质表达在miR-表达的实验诱导时明显降低调节。这些观测表明，miR-中压性抑制RBPJ和p53至少是导致MMC诱导成纤维细胞极化的机制之一。

为了确认miR-对MCC诱导成纤维细胞极化的相关性，我们在将miR-标记剂引入MCC细胞或成纤维细胞后重复了共培养实验。MCC细胞中的miR-反代体显著减少了内源miR-表达，导致相应CMs和隔离EV中miR-的含量同样降低。因此，将miR-雄细胞引入MMC细胞，通过DC或TC条件减少其对向成纤维细胞转移的影响，这与共培养成纤维细胞中α-SMA蛋白和ACTA2、CXCL2和IL1BmRNA的诱导减少有关;与TC条件相比，在DC下，蛋白质和mRNA表达的变化更为明显。MCC细胞中miR-敲击对CAF极化能力的影响被直接解释为，它们对RBPJ和TP53mRNA的影响减小，在共培养后，在DC下，这种效应在DC下比TC条件更为明显。

在三叶细胞中引入miR-反刺剂大大减少了在TC或DC条件下从MCC细胞转移的miR-的可检测量。然而，阿塔戈米人的能力效率较低;事实上，即使在直流条件下的成纤维细胞中可检测到的miR-的标记量也超过了在没有标记体的情况下在TC条件下观察到的量。因此，在成纤维细胞中，由安塔戈米尔表达引起的共培养诱导成纤维细胞极化的逆转不那么引人注目。尽管如此，在TC条件下，ACTA2mRNA和α-SMA蛋白表达的诱导在存在前列腺瘤时显著减少。同样，RBPJ和TP53mRNA的表达被miR-反标记部分救出。

为了将我们的体外观察转化为临床环境，我们在一系列MCC肿瘤样本上用miR-探针进行了原位杂交（ISH）。miR-主要在MCC细胞中表达，但也存在于具有成纤维细胞形态的频闪细胞中（。miR--阳性频闪细胞的特点是与α-SMA表达细胞具有相同的形态外观和分布模式。因此，我们在20个MCC病变中建立了相对α-SMA染色分数，并与RT-qPCR确定的miR-表达关联此分数，显示出显著的正相关关系。此外，RBPJ和TP53的表达式与miR-表达式呈负相关。上文所述主MCC的scRNAseq数据的基因集富集分析（GSEA）比较CAF高和卡夫低基于已建立的CAF分数的成纤维细胞聚类表明，p53相关通路在CAF中受到更强烈的抑制高成纤维细胞比在卡夫低成纤维细胞。这些原位和外体发现强烈支持以下观点：miR-从MMC细胞水平转移到成纤维细胞，通过降低RBPJ和p53的调节，触发后者向CAF型的极化。