研究概述内皮细胞具有组织特异性，参与器官发育和再生。体外培养的成熟内皮细胞丧失这一适应性，不能以器官特异性的方式参与组织的血管化。本研究发现，在体外无血清三维基质中培养的人成熟内皮细胞中短暂重激活胚胎期表达的ETS转录因子变体2（ETV2）可以“重置”这部分内皮细胞，基质含有层黏连蛋白、巢蛋白以及IV型胶原纤维（LEC基质），从而使得内皮细胞具备适应性和血管生成的能力，形成可灌注的血管丛。通过染色质重塑，ETV2诱导成管相关信号通路，包括RAP1活化，促进持续性血管腔的形成。在三维基质中，细胞不受到人工支架材料的限制，重置的血管内皮细胞（R-VECs）在特定的腔室内自组装形成稳定、多层且具备分支结构的血管网络，并且形成的血管可以运输血液。在体实验中，将R-VECs皮下注射至小鼠体内，内皮细胞可以自组装形成稳定的血管结构，并且可以和小鼠体内的血管发生吻合，而不发生畸变和血管瘤等异常表现。在三维共培养的类器官中，R-VECs直接与其他细胞相互作用，无需人工合成的半透膜等材料，实现模拟生理情况下的血管化，称之为“血管网络上的器官”。R-VECs可以灌注人胰岛组织，使得去细胞的大鼠小肠以及结肠类器官发生血管化。进一步通过单细胞测序和表观遗传谱发现R-VECs具备组织特异性。本研究由威尔·康奈尔医学院的ShahinRafii教授研究团队共同开展，于年9月份发表于《Nature》杂志上。研究背景毛细血管网络中的内皮细胞维持组织特异性的稳态，并且血管源性因子参与器官再生。相反，内皮细胞丧失适应性与瘢痕形成和肿瘤发生发展相关。内皮细胞具备组织特异性的机制以及其在瘢痕组织或肿瘤微环境中的改变机制尚不清楚。阐明血管异质性的分子机制需要建立功能性的血管网络，同时能够对微环境和生物物理信号做出响应。为了揭示成熟内皮细胞与非血管细胞之间的相互作用，采用去细胞支架，器官芯片模型和三维生物打印，以及类器官作为研究模型存在局限性。上述模型中，由于人工合成半透膜材料形成物理分隔，微流控装置内体积小且缺乏具备适应性的内皮细胞，因此内皮细胞不能与实质细胞或肿瘤细胞进行直接相互作用。并且，采用类似于Matrigel的基质胶作为基质在临床转化过程中遇到挑战。因此，将转录重置的成熟内皮细胞培养于成分已知的基质内，所形成的具备适应性和成管能力的内皮细胞，有助于深入理解血管多样性，推动器官再生的治疗。发育过程中，转录因子ETV2发挥诱导血管细胞分化和管腔形成的作用。在血管新生过程中，内皮细胞表达ETV2，但是在妊娠中期，当原始毛细血管网络形成后，ETV2表达终止，并且成年内皮细胞中不会表达。实质细胞内短暂重激活ETV2可以使其表现出稳定内皮表型。本文，研究者发现ETV2除了与内皮细胞命运决定相关外，短暂重激活成熟内皮细胞表达ETV2可以表现为胚胎期样具备生成血管能力的内皮细胞，因此称之为“R-VECs”。R-VECs可以自组装形成具备适应性的3D管腔性血管网络，可以运输血液，使得去细胞组织，胰岛以及类器官发生血管化，并在体内形成稳定的毛细血管。研究结果1.R-VECs在体外形成稳定的血管网络通过慢病毒转染人内皮细胞使之表达ETV2，内皮细胞在无血清的培养液中经过三个阶段形成功能性的3D血管网络。在第一个诱导阶段，ETV2上调二维培养中内皮细胞的血管新生和成管相关因子。在第二个重塑阶段，R-VECs培养于机制中，自主装形成出芽且管腔化3D血管。在第三个阶段，R-VECs不再增殖，维持稳定的三维毛细血管结构。与对照组的脐静脉内皮细胞相比，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）转染ETV2后，8周时间内形成的血管面积比对照组高50倍。接下来，研究者探讨R-VEC是否可以在没有基质胶的情况下形成血管。研究者发现，将层黏连蛋白，巢蛋白以及IV型胶原蛋白以特定比例配制，足以使得R-VECs自组装形成管腔化的血管。后续实验中将这一复合基质简称为LEC基质。共聚焦和电镜图片显示，R-VECs形成的血管是连续的，且具有管腔结构，并且在基质胶和LEC基质中呈现出顶部-基部的极性。并且转染ETV2降低成熟内皮细胞的刚度，有助于其形成管腔结构。进一步研究发现，与其他转录因子如ETS1或myrAKT1相比，形成管腔的特性是ETV2特有的。研究者对不同阶段内皮细胞内ETV2的mRNA和蛋白质水平进行定量分析发现，ETV2蛋白质在第二阶段表达达到峰值，而在第三阶段蛋白表达显著下调，而mRNA水平仅轻微下降。进一步发现，短暂激活ETV2表达足以使得成熟内皮细胞自组装形成稳定的血管网络，并且不影响细胞活性和增殖能力。图1a-e：R-VECs在体外自主装形成三维管状血管。2.R-VECs在体内形成持久的血管在免疫缺陷的SCID-beige小鼠皮下接种重悬于LEC基质中荧光标记的对照人内皮细胞或R-VECs。接种后的1-5月时间内，R-VECs在体内自组装形成稳定存在且分支状的血管，而对照组内皮细胞则不能形成。通过人血管内皮细胞钙黏蛋白染色发现，R-VECs血管与小鼠血管发生吻合，形成可灌注的嵌合体血管结构。小鼠血管周围的细胞同时也会包绕R-VECs血管，并且根据血管直径大小不同，平滑肌细胞覆盖程度也不同。通过小鼠静脉注射70kDa右旋糖酐发现，右旋糖酐并不会向血管外渗透，说明在体内形成的血管是完整的且具有空腔结构。相反，转染KRAS的内皮细胞形成不完整的无序的血管，类似于血管瘤。总的来说，R-VECs形成持续的，可与在体血管相吻合的，由周细胞覆盖的毛细血管，并且血管的结构正常，不存在血管异常或肿瘤的表现。图1f-h：R-VECs在体内形成持久血管3.R-VECs使得去细胞支架发生血管化接下来，研究者探讨R-VECs是否可以长入去细胞的组织内。尽管内皮细胞可以定植于去细胞支架内的大血管，但是其进入更小的毛细血管则存在挑战。第一阶段的R-VECs可以完全定植于大鼠小肠去细胞支架内狭窄的毛细血管中。将这部分小肠外植体移植到免疫缺陷小鼠的网膜内发现，R-VEC血管化的支架维持空腔结构并与小鼠的血管相互吻合。在第四周，与对照组内皮细胞相比，R-VEC血管可以在体内维持，因其具备更好完整性以及低水平的凋亡。因此，R-VECs能够使得去细胞组织形成功能性的血管。图1i-j：R-VECs与小肠去细胞支架血管化。4.ETV2重塑内皮细胞至原始血管丛状态为了阐明ETV2参与血管重置的机制，研究者对第一阶段的R-VECs和对照组内皮细胞进行单细胞测序（RNA-seq）。GO分析发现，上调基因相关的信号通路富集到血管发生，血管新生，GTP酶活性，细胞外基质重塑以及机械刺激响应相关的通路上。在第一阶段，R-VECs通过稳定内皮细胞特定基因维持其血管特性。通过R-VECs和对照组内皮细胞组蛋白修饰的免疫共沉淀和测序分析发现，ETV2结合血管特定基因和促进血管形成基因的启动子。因此，ETV2通过直接激活成管和血管新生相关基因改变成熟内皮细胞染色质和转录组学。进一步，ETV2通过上调RAP1GEFs增强内皮细胞的管腔形成能力。第三阶段的R-VECs上调机械感受和内皮细胞重塑相关基因的表达。总的来说，ETV2重置成熟内皮细胞的染色质谱，使之具备在体生理特性，能够对微环境中的刺激做出响应和适应性改变，类似于具备血管形成的内皮细胞。图2：R-VEC的转录组学和表观遗传分析5.R-VECs形成具备血流动力学的血管在微流控装置中，进一步检测R-VEC血管自发形成血管网络的能力。将R-VECs或者对照组内皮细胞接种于5×3×1mm的微流控装置内。培养三天后，R-VECs自主装形成多层次，具备分支结构且相互连接的血管丛，维持其三维管腔结构的稳定性。值得注意的是，R-VEC血管可以实现肝素化全血灌注，在血流灌注过程中，内皮细胞形成的毛细血管网络维持血管的完整性和血流动力学稳定性，同时不会发生塌陷、逆流或者血栓形成。因此，R-VECs维持血管化组织的血流动力学，并为建立血管网络上器官平台奠定基础。图3a-e：R-VECs形成具备血流动力学特性的血管。6.R-VECs使得胰岛组织发生血管化接下来探讨R-VECs在可灌注的微流控装置内使得人胰岛组织血管化的潜能。胰岛组织需要与内皮细胞之间进行活跃的相互作用从而维持胰岛的功能。研究者在微流控装置中接种人胰岛组织，并且与对照内皮细胞或R-VECs进行共培养。三天后，R-VECs可以形成连续性的三维血管网络包绕胰岛，并且可以灌注分泌胰岛素的β细胞。采用葡萄糖刺激试验评估胰岛功能，结果发现R-VECs包绕的胰岛可以对高浓度葡萄糖刺激做出响应并分泌胰岛素。R-VEC与胰岛共培养的体系中，葡萄糖刺激引起胰岛素分泌增加7倍。因此，R-VECs在微流控装置中自主装形成血流动力学稳定的血管，可以进行生理性灌注并维持胰岛β细胞对葡萄糖的响应性。图3f-l：R-VECs与人胰岛组织血管化7.R-VECs与类器官和肿瘤类器官的血管化为了模拟内皮细胞在组织和肿瘤中特异的适应性反应，研究者进一步探讨R-VECs使类器官发生血管化的能力。正常结肠类器官（COs）与内皮细胞混合后与基质胶或LEC基质重悬。与对照组内皮细胞相比，R-VECs可以持续包绕结肠类器官，并且形成的血管面积更大。通过72小时的动态成像发现，R-VECs与结肠类器官内的细胞相互作用更显著。在R-VECs细胞存在的情况下，结肠类器官表面积更大，但其分化状态并未改变。因此，R-VECs可以维持结肠类器官的增殖和完整性，同时其分化状态不发生改变。肿瘤血管内含有异常的毛细血管，同时可以产生异常因子维持肿瘤生长。为了明确R-VECs是否会具备肿瘤血管的异常表现，研究者将R-VECs与病人来源的结直肠癌类器官进行共培养。24小时内，R-VECs迁移并渗透进入肿瘤类器官内。与对照组相比，R-VECs与结直肠癌类器官共培养体系中形成的血管面积大于对照组，并且内皮细胞与CRCOs之间的相互作用也更加显著。因此，R-VECs建立的适应性三维血管微环境可以用于解读内皮细胞与正常或肿瘤类器官之间的相互作用。图4：R-VECs使正常类器官和肿瘤类器官发生血管化。8.类器官和肿瘤类器官中R-VECs的适应性
接下来对血管化的人结肠类器官或肿瘤类器官进行单细胞测序分析，探讨R-VECs的适应性。与R-VECs单独培养相比，与正常或肿瘤类器官共培养的内皮细胞呈现出分群和基因表达的改变。R-VECs与正常结肠类器官共培养后，基因表达富集到器官特异性的标记基因，包括PLVAP和TFF3。相反，与结直肠肿瘤类器官共培养的R-VECs富集到肿瘤内皮细胞相关的基因，包括ID1，JUNB以及ADAMTS4，同时紧密连接完整性相关的基因（如CLDN5）表达减少。与R-VECs内皮细胞相互作用后，结肠肿瘤细胞上调表达与预后差和高转移性相关的基因。这部分实验数据说明，R-VECs模型形成具备组织特异性的血管微环境，并且可以对微环境刺激作出响应。
醉翁之艺点评
本研究通过转录重激活成熟内皮细胞中的转录因子ETV2，改变内皮细胞的转录组学和染色质谱，从而使得内皮细胞获得血管新生和血管形成的特性。本研究建立的血管网络上的器官模型有助于代谢、免疫以及生理化学研究，探讨器官特异性的内皮细胞与实质细胞间相互作用，有望推动器官修复和肿瘤靶向治疗。
（曾羽连，庄蕾）预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
