//研究背景
肿瘤微环境和肿瘤细胞之间以及细胞内部的相互作用促使它们采取畸变或转换到代偿调节途径，以对抗单一治疗药物的效果。不同RTKs之间的串扰可以介导对RTK抑制剂单一治疗的耐药性。此外，afatinib与MET/ALK抑制剂crizotinib联合使用，可以克服对ERBB抑制剂afatinib的耐药。最近研究表明，在BRAF抑制剂耐药的CMM细胞中，MET下调导致EGFR的上调和pAKT的诱导，而这些上调被EGFR和MET的同时下调所阻断。此外，作者已经证明，阿法替尼和克唑替尼联合用药可以在CMM细胞和异种移植物中起到相加/协同作用，且不依赖于BRAF/NRAS突变状态。
在此，作者通过对CMM细胞系和异种移植物的蛋白组学分析，利用质谱和RPPA来阐明阿法替尼和克唑替尼联合治疗背后的分子机制，并基于上述研究结果通过免疫印迹和免疫荧光进一步验证联合治疗靶点的候选蛋白。在临床样本中，候选基因也与BRAF/NRAS突变状态和肿瘤分期有关。此外，作者在CMM细胞中诱导了对联合治疗的耐药性，以确定候选药物可能的耐药性，并通过停止治疗来分析耐药性是否可逆。
//研究结果
RESULT1高通量蛋白质组学分析表明mTOR和胰岛素信号通路参与了CMM联合用药治疗
先前研究表明CMM细胞对afatinib和crizotinib的联合治疗敏感，且不受BRAF/NRAS突变状态的影响。在本次研究中，加入-Lu,和细胞系验证这一发现(图1a)。作者利用总磷酸化蛋白组学平台来阐明afatinib和crizotinib联合治疗效应的潜在机制，比较了两个CMM细胞系（BRAA和NRASSKMel2）暴露于afatinib、crizotinib及其组合3h后的早期蛋白组反应。将组合药物治疗与对照(DMSO)和单一治疗进行两两比较，以识别显著差异表达蛋白(p0.05)，以火山图和文氏图表示(图1b)。在这两种细胞系中，观察到afatinib和crizotinib联合治疗相比于单一治疗或DMSO组，调节复合物的蛋白发生了显著下调(图1b)，且这些蛋白已被证明在溶酶体信号的传输和转运、mTORC1和ERK信号调控中具有多种作用。此外，在A中AKTS1下调，在SKMel2中pMAPK7下调，支持了异种移植模型结果(图1b)。
图1
RESULT2体外联合治疗可下调RPS6KB1、RPS6和IRS-1
作者利用A、AVR4、SkMel2、ESTDAB和ESTDAB细胞系进行RPPA试验，以捕获由afatinib和crizotinib单独或联合使用诱导的早期(3h)和晚期(24h)的蛋白质改变。发现afatinib和crizotinib共同处理3h时，所有细胞系中的pRPS6受到显著抑制(图1d,e)；其中3个细胞系经过24h处理后，pAKT仍保持下调。此外，这些数据证实了afatinib和crizotinib联合治疗后，体内pAKT表达下调。在比较DMSO和联合用药时，胰岛素信号转导中的IRS-2是A磷酸蛋白组学分析中下调最多的蛋白之一。然而，由于RPPA中没有这种蛋白，检查了另一种胰岛素受体底物IRS-1，并观察到SkMel2和AVR4联合处理24h后IRS-1蛋白表达总量略有下降(图1e)。
RESULT3在异种移植模型中，联合治疗下调mTOR和胰岛素信号通路中的关键物质
在体内模型中，进一步研究了通路和蛋白的改变是否与联合治疗效果相关。afatinib、crizotinib及其联合治疗肿瘤异种移植模型(通过注射A细胞建立)，并利用RPPA分析(图1c)。结果显示，afatinib和crizotinib联合治疗导致胰岛素和PI3K-AKT信号通路中的蛋白下调(图2a,b)。由于mTOR通路与下游效应器可以通过负面反馈调节IRS-1的信号,通路分析还表明，mTOR和胰岛素通路下调。作者使用mTOR、IRS-1、AceCS1、pRPS6KB1和RPS6KB1的IF试验来验证结果，从每个治疗组中随机选择3个异种移植样本，与单一治疗或溶剂对照相比，在afatinib和crizotinib联合治疗后，未观察到mTOR和AceCS1的下调(图2c)，而IRS-1表达整体下降，且IRS-1曾被证明介导BRAFi耐药(图2c)。此外，在三例经过验证的病例中，作者观察到联合治疗组的肿瘤细胞缺乏IRS-1核染色，而其他所有治疗组的肿瘤细胞都有可识别的IRS-1核聚集(图2c)。
为进一步验证MS和RPPA结果，单独或联合使用afatinib和crizotinib处理7个CMM细胞系3h，免疫印迹分析蛋白表达情况。联合用药后，A、AVR4和中总IRS-1，或pIRS-1S诱导的和SkMEl2的总IRS-1均下调(图2d,e)。此外，除了ESTDAB内源性表达水平降低之外，p-RPS6KB1和RPS6(5/6)在联合用药后表达水平降低。此外，观察到AVR4中mTOR下调(图2c-e)。乙酰CoA参与癌细胞对碳的代谢。根据RPPA结果，乙酰CoA合成酶AceCS1在联合用药后显著下调(图2c,d)。
图2
RESULT4在CMM细胞中，共沉默IRS-1和RPS6比沉默单个基因更能诱导细胞凋亡
IRS-1和RPS6、下游的RPS6KB1在联合用药后表达下调，IRS-1和RPS6过表达都与MAPKi耐药的发生有关。基于致癌基因驱动的突变，选择了四种细胞系(A、AVR4、SkMel2和)，并使用四种不同的siRNAs验证了IRS-1和RPS6的沉默(图3a)。此外，作者通过沉默siRNAsIRS-1和RPS6验证了沉默效率(图3b)。虽然单独沉默RPS6或联合沉默IRS-1可有效抑制所有细胞系的细胞增殖，但沉默IRS-1对BRAFWT细胞、NRAS突变体SKMel2和BRAF/NRASWT的菌落减少时沉默IRS-1和RPS6会进一步显著诱导细胞死亡(图3e)。FACS分析确定沉默IRS-1和RPS6后是否改变细胞对该药物组合的敏感性。药物治疗24h后，敲低基因表明，联合用药介导的AVR4和SkMel2细胞死亡至少减少约45%。单独沉默RPS6并不介导细胞死亡的显著损失(图3f,g)。
作者使用免疫荧光法对56例CMM患者的65个III/IV期肿瘤进行IRS-1和RPS6KB1总蛋白表达染色，这些患者亚组在活检前接受了靶向疗法、免疫治疗和/或化疗(图3h)。13%的肿瘤主要为IRS-1膜染色，28%的样本主要为IRS-1核定位。约17%的肿瘤IRS-1低表达(图3h)。在约27%的肿瘤中，RPS6KB1无表达，其中9例IRS-1低表达。
图3
RESULT5在CMM的不同阶段，IRS-1、RPS6KB1和RPS6的蛋白表达和定位模式存在差异
为了确定RPS6KB1、RPS6和IRS-1蛋白的表达水平是否随CMM的分期而变化，分析了42份肿瘤样本(I期和IV期)和5个正常皮肤组织。结果表明，RPS6KB1和IRS-1蛋白在III、IV期中表达高于I、II期或正常皮肤(图4a)。约53%的III/IV期肿瘤RPS6KB1表达增强，而约4%的I/II期肿瘤高表达RPS6KB1(图4b,c)。作者发现所有病例均存在RPS6KB1的核定位，主要在IV期肿瘤中出现胞质定位。此外，IRS-1核定位主要存在于III-IV期肿瘤中（70%），而在I-II期肿瘤中仅为28%(图4b)。相反，RPS6的表达不受疾病分期的影响(图4c)。MET是增加肿瘤侵袭性和耐药的因素和crizotinib的靶点，作者评估了其在肿瘤中的表达，结果显示，在III-IV期中，MET表达增加(图4a,b)。
图4
RESULT6停药可以逆转联合用药诱导的耐药性
在异种移植研究中使用了A，因此选择该细胞系单独或联合给药诱导其对afatinib和crizotinib的耐药性(图5a)。细胞暴露于IC50药物浓度约2个月，直到细胞对IC50药物浓度产生耐药(图5b)。为了验证诱导的耐药性是否可以恢复，细胞停药14天，之后再次用药来测定其对药物的敏感性。数据表明，联合用药诱导的耐药性是可逆的(图5b)。然而，停药并没有改变单一治疗的耐药性。用RPPA识别出现耐药性时可能发生的分子变化，许多蛋白的表达水平随着耐药的发生而改变，包括gp/PMEL、CD/L1CAM、GAB2、mTOR和PI3K-p85，这些蛋白在包括CMM在内的肿瘤中被上调并促进肿瘤发展(图5c)。在接受BRAFi靶向治疗的两例患者的肿瘤活检中，也发现了PMEL、CD/L1和mTOR被诱导(图5d,e)。
图5
//总结与讨论
mTOR通路与包括CMM在内的多种癌症中BRAFi耐药的出现有关。mTOR介导的耐药可以通过MAPK途径以细胞自主的方式发生，也可以通过分子信号的动态重组以非细胞自主的方式发生，从而导致近端癌细胞出现耐药。
本篇，作者证明了阿法替尼和克唑替尼联合使用能够抑制mTOR通路的下游效应因子RPS6KB1和RPS6以及胰岛素信号通路中的IRS-1下调mTOR/胰岛素等关键通路。此外，同时沉默RPS6和IRS-1导致进一步诱导细胞死亡。因此，同时靶向两条通路的蛋白可能为CMM患者提供了新的治疗选择。进一步的验证研究将证实同时沉默胰岛素和mTOR信号通路作为一种潜在的临床治疗方案的影响。
//原文信息
本文于年10月20日在线发表于杂志：CellDeathDisease，第一作者是IshaniDas
，通讯作者为SuzanneEgyháziBrage，德克萨斯大学为通讯单位。
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