研究背景
G蛋白偶联受体(GPCR)在激活后，可以参与多种信号蛋白的合成，包括异三聚体G蛋白和多功能衔接蛋白(β-arrs)，然后进行受体运输并调节不同信号通路。
在细胞表面受体酪氨酸激酶(RTK)中，胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)参与了多种癌症过程。IGF-1R属于二元开关系统，当稳定在“开”状态时，呈现出激酶依赖性，激活下游信号因子。而最近报道称，重要的GPCR效应因子都可以调节IGF-1R，其中β-arrs可以将E3泛素连接酶Mdm2带入配体激活的IGF-1R，触发受体泛素化和降解。β-arrs不仅可以诱导IGF-1R活性下调，还可以激活新的信号通路，此时激酶与β-arrs表现出协同作用，而那些用于抑制IGF-1R的药物对β-arrs信号(β-arrs-BS)也有明显作用。因此IGF-1R靶向单克隆抗体CP-(CP)可能是抗IGF-1R药物治疗尤文肉瘤无效的原因。
大多数以IGF-1R为靶点的抗体可以抑制激酶活性，下调受体，同时也抑制了相关信号通路的下调。因此在该文献中，作者研究了GRK2(G蛋白偶联受体激酶2)和GRK6亚型在控制IGF-1R转运方面的能力，将其作为促使癌细胞的IGF-1R下调的潜在目标。
研究结果
1.GRK2/6的调节改变IGF-1R表达
因为细胞的增殖/存活均依赖于IGF-1R，因此作者研究了GRK2/6的调节对IGF-1诱导增殖的影响作用。作者选择尤文氏肉瘤(ES)细胞作为实验模型，结果所有细胞中均表达了IGF-1R、GRK2和GRK6。再用WB检测细胞数量，结果显示敲除GRK2或过表达GRK6的细胞数量减少，而过表达GRK2和敲除GRK6的细胞数量变化较小(图1A)。
为了探索是否是由于GRK2/6的不平衡导致受体的表达量改变，通过WB检测敲除GRK2/过表达GRK6中配体诱导的IGF-1R的下调量有所增加，反之过表达GRK2/敲除GRK6结果相反(图1B)。作者又进行了多次实验，通过密度定量法证实这一结果(图1C)。在GRK2/6比例失衡的情况下，在添加配体之前引发配体降解，结果显示IGF-1R的表达水平降低(图1D)。
图.1
2.调节GRK2/6以控制IGF-1R信号和细胞存活
接下来作者探索了抑制GRK2和过表达GRK6对于IGF-1信号的时间动力学的影响，用IGF-1刺激转染细胞60分钟，使配体磷酸化，然后用WB检测AKT和ERK1/2，以此作为IGF-1R依赖性信号激活的标记物，结果与对照组相比，在所有细胞系中GRK6+和GRK2-使pIGF-1R和pAKT降低(图2A)。此外，在GRK6+和GRK2-细胞的最后时间段pERK信号活性得以维持(图2A)。作者又在无血清的IGF-1试验中用poly-2-HEMA阻止黏附，结果GRK6+和GRK2-不断降低细胞的增殖/存活率，使细胞的数量低于对照组(图2B)，这表明了持续的ERK信号不足以补偿受体的下调。
图.2
3.药理性抑制GRK2可以通过β-arr1依赖性机制下调IGF-1R
作者在有或无PX情况下，用IGF-1刺激HEK细胞，结果在未治疗的细胞中，β-arr1沉默减轻受体的IGF-1依赖性降解，不影响IGF-1R的表达，此外PX治疗通过降低受体水平重现了siGRK2的作用，在低配体条件下最为明显(图3A)。用同样的实验系统和短时IGF-1治疗，作者研究了PX是否可以引发IGF-1R的下调，促进ERK信号通路的激活，PX治疗不仅抑制IGF-1诱导的ERK磷酸化，而且也降低了ERK的活性。在缺乏β-arr1时，用PX治疗1小时可以使细胞对于IGF-1的反应降低(图3B)。在表达β-arr1和IGF-1R的野生型MEF中，经PX治疗会使受体下调，增加配体诱导的受体降解(图3C)。然而，在缺乏β-arr1和IGF-1R时，这些结果会消失，数据表明PX治疗会引发IGF-1R下调并抑制IGF-1诱导的ERK激活(图3D)。总之，这些实验进一步证明了PX诱导的IGF-1R的下调依赖于β-arr1/IGF-1R反应。
图.3
4.β-Arrs亚型的功能差异是控制PX诱导受体下调的机制
作者接下来研究了PX治疗对于IGF-1R泛素化及其对Mdm2的依赖性，用两种人骨肉瘤细胞U2OS和SAOS2进行实验，结果PX对高Mdm2表达的U2OS的受体降解更加有效，而对于SAOS2的效果差一些(图4A)。在两个骨肉瘤细胞中，与对照组相比，IGF-1诱导的ERK信号在PX治疗后更加难以维持(图4B)，这表明PX引发的IGF-1R耗竭不会传递MAPK信号。而与对照组相比，15μlPX治疗U2OS细胞可能会造成ERK的磷酸化增加(图4B)。同时，IGF-1显著激活MAPK通路，在经过PX、αIR3和CP治疗后降低了激酶依赖性pERK信号(图4C)。
为了证明是否是PX治疗本身导致了IGF-1R的泛素化，作者在SFM中培养未经治疗的U2OS细胞，结果受体泛素化水平十分低，在PX治疗一小时后显著增加，同时PX治疗也可以增加SAOS2细胞中的IGF-1R泛素化(图4D)。
为了解释两种β-arr亚型与IGF-1R反应的机制及其配体依赖性，作者用WB分析经IGF-1R和β-arr亚型FLAG标记部分转染的U2OS细胞，结果在缺乏IGF-1时，β-arr2/IGF-1R免疫沉淀中可以清晰的检测出IGF-1R；当有IGF-1刺激时，β-arr1被招募到激活受体中而β-arr2脱离。用PX治疗后，未激活的受体与β-arr1的缔合增加，β-arr1在配体刺激后2分钟迅速从受体脱离，且β-arr2/IGF-1R反应水平一直很低(图4E)。
图.4
5.PX治疗可以下调IGF-1R并抑制尤文肉瘤细胞在体外的生存能力
作者观察用低、高两种浓度的PX治疗对于IGF-1R的表达和信号的影响。结果所有的ES细胞均以时间依赖性和剂量依赖性行为下调IGF-1R(图5A)。用低浓度的PX治疗一小时后，可以引起受体与细胞表面的分离，且IGF-1诱导的ERK信号也不会有所增加(图5B)。最后为了探索通过GRK2抑制靶向IGF-1R的影响与信号传导相关的策略对ES生存能力的影响，作者进行了克隆形成测定实验，注射单剂量PX并培养14天后可以检测到每种细胞的分化情况(图5C)，这表明存在剂量依赖性抑制。总之这些结果表明，通过以IGF-1R为靶点抑制GRK2对于下调IGF-1R更加有益。
图.5
6.PX治疗可以下调IGF-1R并抑制尤文肉瘤在体内的生长
最后为了检测动物模型中PX对于ES细胞生长的抑制作用，建立了A转移瘤小鼠模型，当肿瘤体积达到65mm3时，每天用PX治疗，同时设置空白对照组(图6A)。观察到肿瘤生长受到抑制，且PX治疗可以导致肿瘤尺寸减小50%、重量减小70%(图6B)。组织学证实了移植肿瘤的生长方式，常规苏木精-伊红染色证实存在小而圆且均匀的蓝色细胞片，胞质少而透明，被少量的基质分成不规则的小叶，与典型的尤文肉瘤生长一致(图6C)。IHC分析IGF-1R的表达，结果在PX治疗后IGF-1R的染色下调(图6C)。用WB分析多个移植瘤的蛋白样本，结果证明在PX治疗后IGF-1R出现了相似的下降情况，同时分析也表明PX治疗不会影响胰岛素受体，进一步又证明了IGF-1R水平的下降幅度与GAPDH或InsR相似(图6D)。总之，这些结果均可以说明GRK2抑制剂可以在体内通过选择性通路下调IGF-1R。
图.6A.B.C
图.6D
结果与讨论
IGF-1R与大多数诱导恶性肿瘤的信号通路相关，因此以IGF-1R为靶点给新型抗肿瘤药物的开发提供了依据。在此文献中，作者提供了一种全新的以IGF-1R为靶点的治疗方法，利用GRK2和/6在指导受体运输中的相反作用，从细胞“内部”引发IGF-1R下调。另一个重要的发现就是药理性抑制GRK2可以促进IGF-1R下调且不显著影响β-arr-BS。
这项研究提供了在细胞内通过操纵GRK/β-arr系统以IGF-1R为靶点的治疗观念。在此验证了广泛应用的药物PX，保证了对IGF-1R的更有效的合理设计，以消除β-arr-BS的下调。以尤文氏肉瘤为例，在依赖IGF-1R生存的肿瘤中，PX介导的IGF-1R下调可有效抑制细胞生长，其治疗效果比靶向治疗更好。同样重要的是，随着越来越多人认识到GRK/β-arr系统可以协调其他RTK的活动，该概念可以用作系统偏倚疗法的起点，选择性以多个RTK为靶点进行治疗药物的开发。
文献来源：该篇文献源于癌症研究在线发表，正在审批还未在杂志发表；第一作者：CaitrinCrudden；通讯作者：LeonardGirnita；通讯单位：卡罗林斯卡生物研究所医院的肿瘤与病理科；
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