北京治疗白癜风的专业医院 https://baike.baidu.com/item/%E5%8C%97%E4%BA%AC%E4%B8%AD%E7%A7%91%E7%99%BD%E7%99%9C%E9%A3%8E%E5%8C%BB%E9%99%A2/9728824?fr=aladdin本文来源：《中华医学杂志》，年，第7期第卷，第-页.
本文作者：裴雨晴崔巍
前言/
表观遗传是在不改变DNA基本序列的前提下，通过调控基因组与环境之间的相互作用而将基因表达或功能改变进行的稳定遗传，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、RNA修饰等。表观遗传学异常被认为是最重要的致癌机制之一，目前人们对DNA和蛋白质修饰的表观遗传调控了解较为深入，但RNA修饰很大程度上仍是未知的领域。
6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)——即RNA中腺苷酸(A)第六位N上发生的甲基化，是真核生物mRNA中最丰富的表观转录组学修饰，占所有腺苷的0.1%-0.4%左右[1]。虽然上世纪70年代即被发现，但直到近年酶学和高通量检测技术的发展才使得m6A动力学与真核生物的各种疾病、发育和细胞过程真正联系起来。
目前在超过25%的人类转录本中验证了00多个m6A峰。这些峰多位于具有RRACH特征(R=G或A,H=A、C或U)的共有基序上，并且富集于长外显子区、靠近终止密码子和3′非翻译区[2]。越来越多研究表明m6ARNA甲基化在肿瘤的形成和发展中扮演着重要且多面的角色。本文旨在介绍m6A修饰的相关蛋白和检测技术，总结其在各种肿瘤中的生物学作用和分子机制，并对m6A修饰潜在的临床应用进行阐述。
m6ARNA甲基化修饰及检测方法
m6ARNA甲基化是一个动态可逆的修饰过程，从催化形成到功能实现主要受m6A甲基转移酶复合物(writers,编码器)、m6A去甲基化酶(erasers,消码器)和m6A读取蛋白(readers,读码器)来调控(图1)。
图1.细胞中m6ARNA甲基化修饰过程及分子功能
?m6A甲基转移酶复合物(编码器)：
m6A甲基转移酶复合物能以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，催化RNA上的m6A修饰形成，主要组分有甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(METTL14)、Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)等。METTL3是第一个发现的甲基转移酶，为该复合体的核心亚基，起主要的催化作用，敲除METTL3可导致m6A修饰活性几乎完全丧失[3]。
METTL14本身不具有甲基转移能力，但能与METTL3以1∶1的比例，形成稳定的异源二聚体，发挥RNA结合支架、变构激活并增强METTL3催化活性的作用[4]。WTAP能稳定核心复合物，促进METTL3-METTL14复合物定位于富含mRNA剪切因子和出核转运因子的核小斑[5]。
另有研究表明[6]，RNA结合基序蛋白15(RBM15)、病毒样m6A转移酶相关蛋白(VIRMA)、Cbl原癌基因样蛋白1(CBLL1)、CCCH型锌指蛋白13(ZC3H13)也可能是m6A甲基转移酶复合物的组成部分，结合并募集复合物至特定位点，影响甲基化修饰过程。
?m6A去甲基化酶(消码器)：
脂肪肥胖相关蛋白(FTO)和alkB同系物5(ALKBH5)是目前鉴定出的两种独立的m6A去甲基化酶，属人源ALKB双加氧酶蛋白家族成员，依赖辅因子Fe2+和α酮戊二酸行使去甲基化功能。年Jia等[7]首次发现FTO在体内诱导RNA上m6A去甲基化，证明了m6A修饰的动态可逆。FTO与核小斑部分共定位，敲低FTO能引起m6A修饰增加，过表达则导致修饰减少。最近还发现FTO对N6，2′-O-二甲基腺嘌呤(m6Am)修饰也具有去甲基化酶活性，表明FTO可能在多种底物上发挥作用。
ALKBH5较FTO具有相当的去甲基化活性，但不同于FTO的氧化去甲基化，ALKBH5是以序列特异性优先选择m6A修饰发挥作用，直接催化m6A到A[8]。ALKBH5在大多数组织中表达，主要定位于细胞核，该基因缺失会导致细胞质中mRNA的全面减少，提示可能参与到mRNA的出核转运中。
?m6A读取蛋白(读码器)：
m6A读取蛋白可以将不同的调节或功能机制募集到含m6A修饰的mRNA上，影响靶mRNA的命运。含YTH结构域的蛋白有保守的m6A结合口袋，是主要的读码器，包括YTHDC1-2和YTHDF1-3。YTHDC1是YTH家族蛋白的核心成员，位于细胞核中，识别m6A后可选择性地募集或抑制不同的剪接因子，影响RNA的可变剪接[9]。YTHDC1还能与剪接因子SRSF3、核RNA输出因子NXF1相互作用，调控mRNA从细胞核向细胞质的输出[10]。YTHDC2含多个解旋酶结构域和两个锚蛋白重复序列，优先结合m6A，能提高转录物的翻译效率，同时降低靶mRNA的丰度[11]。
YTHDF1的分布模式与mRNA上m6A位点总体一致，可与真核起始因子、核糖体共同作用，增强mRNA的翻译效率[12]。YTHDF2通过直接募集去腺苷化酶和脱帽酶复合物，将处于翻译池的mRNA导向至加工小体，加速m6A修饰转录物的衰变和降解[13]。YTHDF3既可以协同YTHDF1作用于核糖体蛋白促进mRNA翻译，又能与YTHDF2合作介导mRNA的衰变[14,15]。
核不均一核糖蛋白(HNRNP)、真核起始因子(eIFs)及个别特殊蛋白也能读取m6A介导的生理作用。HNRNP含有RNA结合结构域，其成员HNRNPC、HNRNPG和HNRNPA2B1在RNA变构、miRNA前体加工中发挥作用[16,17]。eIF3能直接结合mRNA5′UTR的m6A位点，以不依赖帽的方式募集43S复合体启动翻译[18]。胰岛素样生长因子2mRNA结合蛋白(IGF2BPs)、FMRP翻译调节蛋白1(FMR1)和富含亮氨酸的五肽重复序列蛋白(LRPPRC)也能读取m6A修饰并影响RNA行为，但其选择性识别m6A修饰转录物的机制仍有待探索。
?m6A修饰的检测方法：
细胞中丰富的m6A修饰可由多种理化方法检测，如液相色谱质谱联用(LC-MS/MS)、薄层色谱(TLC)、斑点印迹、比色法等。这些方法主要从整体水平上判断mRNA上m6A修饰存在与否，不适合做高通量分析，也无法鉴定出修饰的具体位点。Liu等[19]开发了一种m6A位点特异性切割和放射性标记然后接头辅助提取和薄层色谱分析(SCARLE)的方法，能够确定m6A残基的精确位置及修饰率，但操作复杂且有放射性污染。
RNA甲基化免疫沉淀测序(MeRIP-seq或m6A-seq)是基于m6A高特异性抗体结合高通量测序的技术，可绘制转录组的m6A图谱。该法将m6A残基定位于~nt长的转录组区域，但不能精确到单个碱基，也无法对修饰定量。由m6A-seq衍生的方法在分辨率和定量检测上进行了改进。光交联辅助m6A测序(PA-m6A-Seq)技术是将核糖核苷4-硫尿苷掺入到mRNA中，免疫沉淀后用紫外光照射形成硫酮结构，在后续测序中呈现出胸腺嘧啶(T)向胞嘧啶(C)的转变以及碱基对读数的改变，从而实现m6A位点的精确识别[20]。经交联和免疫沉淀以单核苷酸分辨率定位m6A(miCLIP)的技术是在紫外光诱导下使片段化的RNA与m6A特异性抗体发生交联，然后对纯化回收的交联片段进行逆转录和测序[21]。如果RNA上存在m6A修饰，则相应的cDNA上会出现高度特异的突变或截短，帮助定位修饰位点。
我国学者最近开发了一种基于m6A敏感性RNA核糖核酸酶的测序技术（m6A-REF-seq）[22]，通过筛选出能特异区分ACA基序的RNA内切酶MazF，实现全转录组内以单碱基分辨率量化m6A水平。该方法不依赖于m6A抗体，大大降低了样本量，检测出的m6A位点与m6A-seq非常相似，但缺点在于该酶识别的m6A序列模式有限。
m6A修饰在肿瘤中的生物学作用
m6A修饰在前mRNA剪接、3′端加工、核输出、翻译调节、mRNA衰变和miRNA加工等多个过程中发挥作用，其动态可逆的变化控制并决定着细胞生长和分化，提示m6A及修饰蛋白的异常也可能在肿瘤的发生和进展中产生相应的病理效应。
?METTL3、METTL14和WTAP：
多数研究表明以METTL3和METTL14为主的m6A编码器发挥着促进肿瘤细胞生长、存活和侵袭的作用。METTL3在胶质母细胞瘤干细胞(GSCs)中表达上调，通过增加干性基因SOX2mRNA的稳定性实现GSCs干性维持和放疗抵抗[23]。肝细胞癌(HCC)中METTL3的高表达可经m6A修饰诱导抑癌基因SOCS2的降解，与患者的不良预后相关[24]。
乳腺癌中METTL3依赖m6A修饰上调HBXIP表达，形成HBXIP/let-7g/METTL3的正反馈环，引起乳腺癌细胞增殖加速[25]。急性髓细胞白血病(AML)中METTL3呈高表达，敲低METTL3会引起细胞周期停滞、凋亡增加、白血病细胞分化、白血病小鼠模型诱导失败[26,27]。同样，在膀胱癌中METTL3也呈现高表达，其介导的靶基因形成一个促癌的多级调控网络[28]。
值得注意的是，METTL3还能以不依赖于m6A修饰的方式影响肿瘤发展，例如直接募集eIF3到转录起始复合物来增强靶基因的翻译[29]。另一种m6A编码器METTL14在造血干祖细胞(HSPCs)和部分型别的AML中高表达，主要维持AML干细胞的自我更新。敲低METTL14促进正常HSPC和AML细胞的髓样分化并抑制细胞的增殖及存活[30]。WTAP在胆管癌尤其在淋巴结或血管内的转移性胆管癌细胞中过表达，能显著增加肿瘤细胞的迁移和侵袭能力[31]，但作为m6A修饰酶参与的致癌过程尚未阐明。
然而，部分研究表明m6A上调也可能抑制某些肿瘤的进展，因此作为m6A编码器的甲基转移酶在其中发挥抑癌作用。例如另一项胶质瘤的研究认为[32]，m6A修饰是GSCs自我更新和癌变的关键，敲除METTL3或METTL14可促进GSCs的增殖、自我更新和肿瘤发生。另一项肝癌的研究也表明[33]，METTL14下调引起了HCC中异常的m6A修饰，与肿瘤转移密切相关，是患者无复发生存的不良预后因素。子宫内膜癌中，无论是METTL14的突变还是METTL3的下调都可激活AKT途径，导致子宫内膜癌细胞增殖和癌变[34]。
?FTO与ALKBH5：
FTO首次被报道在MLL重排的AML和急性早幼粒细胞白血病中以m6A消码器的作用促进白血病细胞增殖、诱导小鼠模型发生白血病、抑制体外凋亡和全反式维甲酸(ATRA)诱导的AML细胞分化[35]。代谢产物R-2-羟基戊二酸(R-2HG)可通过抑制FTO活性、增加白血病细胞中总m6A修饰水平来抑制肿瘤相关信号通路的活化[36]。Cui等[32]表明FTO在胶质母细胞瘤中具有促癌作用，其抑制剂可增加GSCs中mRNA的m6A修饰水平并抑制GSC的生长。随后研究陆续报道了FTO在宫颈癌[37]、肺癌[38]、乳腺癌[39]等肿瘤中一致的促癌效应。只有一项研究发现FTO在肝内胆管细胞癌中表达下调，发挥抑制肿瘤生长的作用[40]。
Zhang等[41]发现乳腺癌细胞暴露低氧环境时ALKBH5、HIF-1表达会增加，介导缺氧肿瘤微环境中乳腺癌干细胞的富集。FOXM1在维持GSCs增殖和自我更新上发挥作用，ALKBH5可使FOXM1转录物去甲基化后加速表达，而FOXM1基因反义链转录的非编码RNAFOXM1-AS能增强两者的相互作用，进一步促进GSC的自我更新、增殖和肿瘤形成[42]。
?YTHDF2、YTHDF1与YTHDC2：
目前与m6A修饰读取蛋白异常相关的肿瘤研究较少。YTHDF2在HCC中上调，其表达水平与具有抑癌效应的miR-呈负相关。miR-通过靶向YTHDF2mRNA的3′UTR来间接影响HCC细胞中m6A修饰[43]。YTHDF2在前列腺癌组织中上调，与肿瘤细胞的增殖和迁移相关，并受到miR--3p的负调控[44]。结直肠癌中，癌基因c-Myc能促进YTHDF1的表达，诱导癌细胞增殖和转移，增加其对化疗药物的抗性[45]。YTHDC2的表达与结肠癌分期、转移呈正相关，敲低该基因可通过HIF-1α抑制肿瘤细胞在体内外的转移[46]。
m6A修饰在临床诊治中的应用前景
作为mRNA中最普遍的修饰，m6A将表观转录组学与肿瘤发生发展联系起来，影响着肿瘤的干细胞自我更新和分化、增殖凋亡、侵袭转移、耐药、免疫抑制等过程，因此参与m6A修饰的关键蛋白有望成为癌症诊治和药物开发的潜在分子靶标。
一项研究检测了肺癌患者循环肿瘤细胞(CTC)中DNA和RNA甲基化状态，首次证实了肺癌患者CTC中m6A修饰水平的升高[47]。该研究提示肿瘤患者CTC上存在表观遗传异常，有助于揭示肿瘤转移的机制，也有望将CTC上m6A修饰用于转移性疾病的监测。胰腺癌中METTL3可能是提高肿瘤患者治疗效果的潜在靶点，将METTL3敲低的胰腺癌细胞对化疗药物(如吉西他滨、5-氟尿嘧啶、顺铂)和放疗更为敏感[48]。在AML中，发生MLL重排、t(15;17)、NPM1突变或FLT3-ITD的亚型对ATRA的治疗比其他亚型更为敏感[35]，原因在于这类内源性FTO高表达的细胞更多地依赖于FTO信号传导增殖，而ATRA治疗可以解除FTO对促分化基因的负性调控。
由于ALKBH5和FTO属于2-氧戊二酸和亚铁依赖性的核酸加氧酶(2OGX)家族，因此，现有的2OGX抑制剂可作为m6A去甲基化酶的非特异性抑制剂，包括2OG拮抗剂、金属螯合剂、二价金属离子等。但这些抑制剂大多不具有选择性，因此研究人员基于FTO和ALKBH5的结构域开发了新的2OGX抑制剂[49,50]。这些拮抗剂与FTO和ALKBH5的活性位点紧密结合，对m6A去甲基化活性显示出较好的抑制效果。有趣的是，最近发现双环加氧酶/脂氧合酶抑制剂也可作为FTO特异性的抑制剂[51]。
Huang等[52]发现甲氯芬那酸(MA)能特异性地与FTO竞争结合核酸上的m6A修饰位点，用乙酯形式的MA(MA2)处理细胞后m6A修饰水平明显升高。同时，使用MA2治疗胶质瘤能显著抑制肿瘤的进展并延长移植瘤小鼠的生存期，表明m6A甲基化可作为胶质母细胞瘤的治疗靶点[32]。MA作为FTO高选择性抑制剂也对我们挖掘现有药物资源带来启发。
小结
目前肿瘤中m6ARNA甲基化的研究仍处于早期阶段，m6A水平及其修饰蛋白的失调似乎起到抑癌和促癌的"双刃剑"作用，合理解释有争议的研究结果具有挑战性。正是这一修饰在功能上的多面性和可调节性，强调了环境在生物学作用中的重要作用。因此m6A的功能可能比现有的报道更加复杂和广泛，但同时也有望为肿瘤发生发展提供深入的见解。近年来，由于高通量测序等技术的可及性，鉴定m6ARNA甲基化的化学基础和生物学功能变得可行，单碱基分辨率、低样本量的m6A高通量鉴定方法也得到不断改进。就临床应用而言，继续探究m6A相关蛋白能否作为潜在的诊断和治疗靶标极具意义。未来有望开发更加特异有效的m6A调节剂，为肿瘤治疗探索新的选择。
参考文献
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